CD56、Galectin-3、CK19及HBME-1蛋白在診斷甲狀腺乳頭狀微小癌和非典型濾泡上皮增生中的價(jià)值*

黃力營,林清群,凌雪君,李發(fā)來,王木蘭

賀州市人民醫(yī)院 1病理科,2腺體外科,3科教科(廣西賀州 542800)

甲狀腺乳頭狀微小癌(papillary thyroid micro carcinoma，PTMC)定義為10 mm以下的甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)。目前的研究證實(shí)甲狀腺良性疾病可能增加患甲狀腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是在甲狀腺功能亢進(jìn)或減退、甲狀腺腺瘤、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和甲狀腺炎[1]。鑒于在上述甲狀腺良性病變中常常觀察到伴有PTC樣細(xì)胞核改變和(或)伴有乳頭狀結(jié)構(gòu)形成的非典型濾泡上皮增生(atypical follicular epithelial proliferation，AFEP)改變[1-2]，且在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和橋本甲狀腺炎(hashimotos thyroiditis，HT)中的AFEP顯示出具有腫瘤性質(zhì)的單克隆性增生[2-3]，這意味著形態(tài)學(xué)上有時(shí)很難區(qū)分出非典型增生和惡性病變。在日常甲狀腺病變?cè)\斷工作中，我們經(jīng)常見到PTMC與濾泡上皮非典型增生的診斷和鑒別診斷，一個(gè)是惡性，一個(gè)是惡性潛能，治療上有很大差異。因此我們采用免疫組化技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)PTMC和良性甲狀腺病變局灶伴非典型濾泡上皮增生病變中CD56、半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、細(xì)胞角蛋白19(Cytokeratin 19，CK19)和人骨髓內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物(HBME-1)蛋白的表達(dá)，探討它們?cè)赑TMC與甲狀腺良性病變伴非典型濾泡上皮增生診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取賀州市人民醫(yī)院病理科2016年4月至2019年2月期間收到手術(shù)切除甲狀腺病變標(biāo)本經(jīng)確診的PTMC材料共45例(其中34例合并結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，5例合并甲狀腺腺瘤，6例合并橋本甲狀腺炎)，腫瘤最大徑0.5～9 mm，平均(2.89±2.461)mm。45例中40例為常規(guī)送檢標(biāo)本，5例為術(shù)中冰凍切片送檢標(biāo)本。男8例，女37例，年齡22～67歲，平均(48.24±11.70)歲。取同期手術(shù)切除診斷甲狀腺良性病變伴局灶非典型濾泡上皮增生病例共30例(其中伴發(fā)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫25例，甲狀腺腺瘤3例，橋本甲狀腺炎 2 例)，男5例，女25例，年齡19～65歲，平均(45.27±13.76)歲。PTMC組與非典型濾泡上皮增生組之間患者年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 免疫組化試劑和方法 標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋，切片厚5 μm，行HE染色和免疫組化染色。免疫組化采用EnVision法，一抗CD56(MX039)、Galectin-3(9c4)、CK19(A53-B/A2.26)、HBME-1和EnVision(Kit-9922)檢測(cè)試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。用已知甲狀腺乳頭狀癌Galectin-3、CK19和HBME-1陽性和小細(xì)胞肺癌CD56陽性切片作陽性對(duì)照，以PBS液取代一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 以下染色模式被認(rèn)為是陽性的：CD56以細(xì)胞膜的染色、Galectin-3細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核、CK19和HBME-1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染色，結(jié)果判讀采用人工計(jì)數(shù)方法進(jìn)行陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度的計(jì)分。陽性細(xì)胞百分比按視野內(nèi)陽性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)的比例計(jì)分：無著色細(xì)胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分、51%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度按陽性細(xì)胞著色特征記分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色強(qiáng)度與著色細(xì)胞比例兩組分值相加，0分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間染色強(qiáng)度表達(dá)差異比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，率等計(jì)數(shù)資料的組間比較采用2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD56在PTMC與良性甲狀腺病變局灶上皮非典型增生中的表達(dá) CD56表達(dá)細(xì)胞膜，在PTMC中的陽性表達(dá)率為6.6%(3/45)，其表達(dá)強(qiáng)度3例均為弱陽性，無中至強(qiáng)陽性表達(dá)模式，而PTMC旁周圍良性病變甲狀腺濾泡上皮中常呈中度而完整的細(xì)胞膜表達(dá)(圖1)；在良性甲狀腺病變伴濾泡上皮非典型增生病變中的陽性率高達(dá)100.0%(30/30)，其中中等陽性表達(dá)為23例，強(qiáng)陽性表達(dá)5例，無陰性表達(dá)病例(表1)。濾泡上皮非典型增生組中CD56的陽性表達(dá)率和染色強(qiáng)度均顯著高于PTMC組(P<0.001)。見表1。

2.2 Galectin-3、CK19和HBME在PTMC與良性甲狀腺病變伴微小上皮非典型增生中表達(dá) Galectin-3、CK19主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，Galectin-3伴有核表達(dá)。HBME-1主要表達(dá)在細(xì)胞膜，包括細(xì)胞腺腔面、乳頭或側(cè)膜部位的細(xì)胞膜表面，伴或不伴有胞質(zhì)著色(圖1)。免疫組化結(jié)果顯示，Galectin-3、CK19和HBME-1蛋白在PTMC中的陽性表達(dá)率分別為100.0%(45/45)、100.0%(45/45)和88.8%(40/45)，陽性表達(dá)模式均以中至強(qiáng)陽性表達(dá)為主，其中中至強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為95.6%(43/45)、100.0%(45/45)和60.0%(27/45)；而在濾泡上皮非典型增生病變中均無強(qiáng)陽性表達(dá)，中度陽性表達(dá)則僅分別為3.3%(1/30)和26.7%(8/30)，且HBME-1無中度陽性表達(dá)病例。值得注意的是，Galectin-3 在良性病變、PTMC及非典型增生周圍的正常甲狀腺組織均呈陰性。而CD19在PTMC中77.7%(35/45)染色模式以強(qiáng)而彌漫的陽性表達(dá)為主，在非典型增生中呈中度陽性表達(dá)占26.6%(8/30)，但其陽性染色呈局灶斑駁狀缺乏彌漫性，在良性病變、PTMC及非典型增生周圍正常甲狀腺組織中可見散在不規(guī)分布灶性濾泡上皮胞質(zhì)中弱陽性表達(dá)。HBME-l在PTMC中表達(dá)的特征是彌漫中至強(qiáng)陽性信號(hào)連接成線狀，而非典型增生病變中為局灶狀弱陽性表達(dá)，在良性病變及周圍正常甲狀腺組織均為陰性表達(dá)。PTMC中Galectin-3、CK19和HBME-1蛋白的陽性表達(dá)率和染色強(qiáng)度顯著高于濾泡上皮非典型增生組(P<0.001)。見表1。

注：A：CD56在PTMC中(-)；B：Galectin-3在PTMC強(qiáng)(+)；C：CK19在PTMC強(qiáng)(+)；D：HBME-1在PTMC中等(+)(EnVision，×100)；E：CD56在AFEP中等(+)；F：Galectin-3在AFEP中(-)；G：CK19在AFEP中等(+)；H：HBME-1在AFEP中(-)(EnVision，×100)圖1 CD56、Galectin-3、CK19及HBME-1蛋白在PTMC和非典型濾泡上皮增生中的表達(dá)

表1 CD56、Galectin-3、CK19和HBME-1蛋白在PTMC組和AFEP組中的表達(dá) 例

2.3 CD56和Galectin-3、CK19、HBME-1標(biāo)記物組合在PTMC中的表達(dá)情況 PTMC組中Galectin-3、CK19、HBME-1三種標(biāo)記物同時(shí)陽性表達(dá)為88.8%(40/45)，而Galectin3/CK19、CK19/HBME-1和Galectin3/HBME-1組合雙陽性率分別為100.0%(45/45)、88.8%(40/45)和88.8%(40/45)。結(jié)果顯示CD56陰性、Galectin-3/CK19雙陽性組合的特異度為93.4%(42/45)，且以中至強(qiáng)陽性染色模式為主，而CD56陰性、CK19/HBME-1或Galectin3/HBME-1雙陽性組合的特異度均為82.2%(37/45)。而在良性病變伴非典型濾泡上皮增生組中CD56均為陽性表達(dá)，其中中至強(qiáng)陽性表達(dá)為93.3%(28/30)，但無Galectin-3、CK19、HBME-1組合中雙陽性表達(dá)的病例。

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌中是否存在癌前病變?nèi)源嬖跔?zhēng)議，有數(shù)據(jù)表明，一些良性結(jié)節(jié)可能具有惡性潛能，并可能具有從良性到惡性的多灶性進(jìn)展。在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫良性背景中和PTC周圍組織中已證實(shí)有顯微鏡下小的非典型濾泡上皮增生癌前病灶的存在[4-5]。Hunt等[6]在慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎的非典型增生區(qū)域觀察到抑癌基因的雜合缺失突變，表明這些非典型區(qū)域是腫瘤性而非反應(yīng)性區(qū)域。已在一些組織病理學(xué)分類的良性結(jié)節(jié)中被證實(shí)存在有包括Gal-3、CITED1、HBME-1、Ras、RET/PTC和PAX8/PPARc等腫瘤標(biāo)志物和遺傳突變呈陽性，已有學(xué)者將其命名為非典型濾泡上皮增生/甲狀腺濾泡上皮異型增生(follicular epithelial dysplasia，F(xiàn)ED)以與反應(yīng)性增生相區(qū)分[2，7]。

PTC可根據(jù)典型的核形態(tài)在細(xì)胞學(xué)和組織標(biāo)本中進(jìn)行診斷。這些形態(tài)在某些PTC變型中可能并不突出，而在某些良性病變下可能會(huì)看到，本組中非典型濾泡上皮增生以伴隨在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中為主，可能與地處廣西桂東地區(qū)有關(guān)，由于地理環(huán)境因素的關(guān)系，本地區(qū)人口橋本甲狀腺炎的發(fā)病率并不高，而結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和甲狀腺腺瘤多見。由于病變微小，在甲狀腺良性病變中從形態(tài)學(xué)上，將具有PTC樣部分核特征的非典型濾泡上皮增生與PMTC鑒別開來，對(duì)病理學(xué)家是一個(gè)挑戰(zhàn)。

CD56是免疫球蛋白超家族的一員，CD56蛋白在正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞中表達(dá)，而在甲狀腺癌中則常表達(dá)下調(diào)或缺乏。以往報(bào)道其在PTMC中陽性率為0～60.0%，甲狀腺良性疾病中為91.7%～100.0%[8]。在我們的研究中，CD56在PTMC中陽性表達(dá)率僅為6.6%(3/45)且為弱陽性染色，無中至強(qiáng)陽性染色模式。而在非典型濾泡上皮增生病變中均為陽性表達(dá)，其中中至強(qiáng)陽性表達(dá)率為93.3%(28/30)。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示非典型濾泡上皮增生組中CD56的陽性率和染色強(qiáng)度均顯著高于PTMC組(P<0.001)。這些結(jié)果表明，CD56表達(dá)下調(diào)在甲狀腺良惡性腫瘤中的診斷和鑒別診斷中具有重要的價(jià)值，根據(jù)陽性表達(dá)情況和染色強(qiáng)度模式有助于我們將良性病變中非典型濾泡上皮增生與PTMC區(qū)分開來。

Galectin-3是β-半乳糖苷結(jié)合蛋白家族的成員，其涉及了甲狀腺上皮的惡性轉(zhuǎn)化過程，目前的研究的熱點(diǎn)集中于其在甲狀腺癌的血清學(xué)診斷標(biāo)記物。以往的研究表明，Galectin-3在PTMC中陽性率為45.7%～98.0%，但在良性病變和正常甲狀腺組織中不表達(dá)，這對(duì)PTMC與甲狀腺良性病變的鑒別診斷非常有價(jià)值[8-9]。我們的研究顯示，Galectin-3在PTMC均為陽性，且中至強(qiáng)陽性表達(dá)占95.6%(43/45)，而非典型增生6例陽性中5例為弱陽性，僅1例為中度強(qiáng)度的染色模式，PTMC組中Galectin-3的陽性率和染色強(qiáng)度均顯著高于非典型增生組(P<0.001)，除作為鑒別PTMC與AFEP的有效指標(biāo)外，其在非典型增生病變中的表達(dá)提示該病變可能具有分化為惡性的潛力。

以往的報(bào)道CK19在PTMC中的陽性率為59.0%～84.0%且呈強(qiáng)而彌漫陽性著色模式，而在甲狀腺良性病變中缺乏或低表達(dá)[10]。本組中CK19在PTMC中均呈中至強(qiáng)而彌漫膜陽性表達(dá)模式，而非典型增生組中陽性著色模式呈局灶斑駁狀，即使在經(jīng)冰凍切片處理后的微小癌組織病灶中也是如此。我們認(rèn)為在鑒別PTMC與非典型增生時(shí)結(jié)合細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征以及CK19染色強(qiáng)度和模式對(duì)區(qū)分兩者十分重要，當(dāng)CK19呈強(qiáng)而彌漫染色模式時(shí)，對(duì)PTMC的診斷有提示作用。同時(shí)，盡管CK19在PTMC中的陽性率和染色強(qiáng)度均顯著高于非典型增生組(P<0.001)，但后者陽性表達(dá)亦達(dá)46.6%(14/30)，其中26.6%(8/30)呈中度陽性染色模式，表明非典型增生中的CK19的陽性表達(dá)提示其可能是一種癌前病變，具有與PTC相似的分子病理改變[2-3]。

HBME-1是一種存在于間皮瘤和濾泡性甲狀腺腫瘤細(xì)胞微絨毛中的膜蛋白。以往的研究證實(shí)在PTC患者中的表達(dá)明顯高于良性甲狀腺病變患者[11]。本研究顯示PTMC組中HBME-1陽性率和陽性表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于非典型增生組(P<0.001)。我們體會(huì)到在惡性病變中，HBME-1在膜(腔內(nèi))線性染色更常見，其以彌漫性、線性和腺腔面、側(cè)膜、乳頭頂端強(qiáng)膜性染色是PTMC與非典型增生鑒別有效的標(biāo)記物之一。

由于PTMC本身病灶微小，形態(tài)學(xué)鑒別PTMC與非典型增生存在困難，運(yùn)用該組合檢測(cè)在CD56陰性的狀態(tài)下，當(dāng)Galectin3、CK19、HBME-1這3個(gè)標(biāo)記物中同時(shí)或3個(gè)中任意2個(gè)組合同時(shí)出現(xiàn)強(qiáng)而彌漫陽性表達(dá)模式時(shí)，即可診斷為PTMC而不診斷非典型增生，這可有效輔助我們將PTMC與AFEP鑒別開來，并為臨床開展個(gè)性化的監(jiān)測(cè)策略和治療決策提供幫助。