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    稀土釹摻雜介孔生物玻璃的微球調(diào)控實(shí)驗(yàn)

    2021-11-01 05:51:52雨,
    實(shí)驗(yàn)室研究與探索 2021年9期
    關(guān)鍵詞:微球孔徑生物

    劉 雨, 張 英

    (1.蘇州大學(xué)a.紡織與服裝工程學(xué)院;b.材料與化學(xué)化工學(xué)部,江蘇蘇州 215123;2.現(xiàn)代絲綢國家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇蘇州 215123;3.南通家紡產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司,江蘇南通 226000)

    0 引 言

    藥物的控制釋放有利于提高藥物療效,減少用藥次數(shù),是生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[1-3]。與傳統(tǒng)的生物玻璃材料相比,介孔生物活性玻璃微球(Mesoporous Bioactive Glass Nanospheres,MBG)具有規(guī)整有序的孔道,較高的比表面積,良好的生物活性,在藥物傳輸方面受到廣泛關(guān)注[4-5]。我國稀土資源豐富,儲量居世界之首。稀土是鑭系元素的通俗名稱,元素包括鑭、鈰、釹等17 種元素[6]。稀土具有獨(dú)特的理化性質(zhì),在工業(yè)及科技領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[7]。在稀土元素中,釹(Nd)元素化學(xué)性質(zhì)較活潑,越來越引起人們的關(guān)注。在鎂或鋁合金中添加少量Nd,可提高合金的耐高溫性能和氣密性[8];摻雜Nd 的激光器可代替手術(shù)刀用于摘除手術(shù)或消毒傷口[9];農(nóng)藥中適量的Nd元素能促進(jìn)作物的生長,提高農(nóng)作物的抗病性[10]。釹鐵硼(NdFeB)磁能積高,被稱作當(dāng)代“永磁之王”,以其優(yōu)異的性能廣泛用于電子行業(yè)[11-12]。但將Nd 用于MBG的研究尚且比較有限,本實(shí)驗(yàn)采用溶膠-凝膠法制備Nd 摻雜介孔生物玻璃(Nd/MBG),研究不同Nd摻雜比對Nd/MBG微球藥物控制釋放能力及其生物安全性的影響,探討其在藥物載體領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要試劑

    十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、乙酸乙酯(EA)、正硅酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)、無水乙醇(EtOH)、氨水(NH3·H2O)、胰酶、高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)。

    1.2 樣品制備

    取1.2 g的CTAB加入EtOH和NH3·H2O中,攪拌溶解后依次加入TEOS、TEP 及不同量的CN 和Nd2O3。反復(fù)離心沖洗,60 ℃干燥24 h,650 ℃空氣下煅燒3 h,得不同Nd摻雜比的Nd/MBG微球(表1)。

    表1 Nd/MBG微球樣品的主要成分

    1.3 形貌表征

    Nd/MBG微球的形貌結(jié)構(gòu)用冷場掃描電子顯微鏡(SEM,S-4700,日本)和透射電子顯微鏡(TEM,F(xiàn)EI Tecnai G-20,美國)表征。表面元素、基團(tuán)變化用X 射線光電子能譜(XPS,XSAM800,美國)及傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR,Nicolet iS5,美國)進(jìn)行分析。比表面積、孔徑分布和吸-脫附等溫曲線用比表面測定儀(BET,ASAP2020(M +C),美國)表征。

    1.4 礦化能力

    稱取0.05 g 的Nd/MBG 微球浸泡于50 mL 的模擬生理體液(SBF)[13],37 ℃恒溫水浴震蕩3 d,丙酮沖洗并干燥,SEM 與FTIR 分析Nd/MBG 表面羥基磷灰石(HA)的礦化能力。

    1.5 藥物裝載

    避光條件下,將50 mg Nd/MBG 微球加入到配置好的DOX 溶液中(0.25 mg/mL,6 mL),震蕩24 h 后離心收集上清液,得到裝載DOX 的Nd/MBG-DOX 微球。紫外可見分光光度計(jì)(UV-Vis,CARY50,美國)測定在480 nm吸光度值,計(jì)算DOX的裝載率:

    式中:Wi為DOX的初始量;Wr為未裝載DOX的量。

    1.6 藥物釋放

    將Nd/MBG-DOX浸泡于7 mL 不同pH 值(pH =4.3、7.4、8.6)的PBS 溶液中,恒溫水浴震蕩,一定時間點(diǎn)取3.5 mL PBS 溶液,UV-Vis 測定吸光度,計(jì)算DOX的累積釋放量:

    式中:Ct為對應(yīng)時間的DOX 濃度;v 為介質(zhì)體積3.5 mL;V為體系總體積7 mL。

    1.7 細(xì)胞毒性

    取濃度為1 × 105個/mL的人骨肉瘤細(xì)胞(MG63)種植到96 孔板中,加入不同濃度(50、100、200 μg/mL)的Nd/MBG 微球及Nd/MBG-DOX 微球。培養(yǎng)1,3,5 d,CCK-8 試劑盒(CCK-8,Sigma,St.Louis,USA)檢測細(xì)胞活力[19],不加材料組為空白對照組。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 Nd/MBG微球的表面形貌表征

    從圖1(a)TEM 可看出,Nd/MBG 微球?yàn)榫鶆虻那蛐?,粒徑達(dá)到納米級,表面存在微小的納米孔隙。不同Nd摻雜量的Nd/MBG微球材料從內(nèi)到外逐漸變得疏松。EDS 圖顯示微球中Si、P 和Ca 元素呈均勻分布,Nd 在MBG 中呈現(xiàn)高度分散的均勻分布(圖1(b))。XPS結(jié)果顯示,0 Nd/MBG微球中存在Si特征峰,未見Nd特征峰。摻雜Nd后的Nd/MBG微球中Si元素圖形與未摻雜時相似,但元素的結(jié)合能變小,電子數(shù)變少,價(jià)態(tài)升高,表明此時的Si 以四價(jià)的形式存在的。Nd元素圖譜中,980 和1 000 eV 處出現(xiàn)明顯的3d 5/2和3d 3/2 的結(jié)合能譜峰,表明Nd3+的存在(見圖1(c))。

    圖1 (a)不同Nd摻雜比的Nd/MBG微球的TEM圖;(b)EDS能譜分析1 Nd/MBG微球表面Si、Ca、P和Nd元素分布;(c)0、2 Nd/MBG微球表面Si4 +、Nd3 +的XPS圖譜

    吸脫附等溫線的形狀與材料的結(jié)構(gòu)有關(guān)[15],利用N2吸附-脫附測試檢測Nd/MBG微球的孔徑及結(jié)構(gòu)變化(見圖2)。不同Nd摻雜比的Nd/MBG微球的洗脫等溫線均為Langmuir IV型等溫線,具有H1 型遲滯回線,表明Nd/MBG微球具有介孔結(jié)構(gòu)。通過BET方程計(jì)算,0 Nd/MBG的比表面積(SBET)、平均孔徑(DP)和孔體積(VP)分別是400 cm2/g、2.7 nm和0.33 cm3/g,隨著Nd摻雜量的增加,微球的SBET略有所減小,但DP略有所增加;1 Nd/MBG 的DP最高到4.5 nm;2 Nd /MBG的SBET、DP和VP分別為177 cm2/g、3.6 nm 和0.22 cm3/g。表明改變Nd 的摻雜量,可以調(diào)節(jié)Nd /MBG微球的大小及孔徑。

    圖2 Nd/MBG微球的N2 吸附-脫附等溫線及孔徑分布曲線

    2.2 Nd/MBG微球體外生物活性

    將不同Nd 摻雜比的Nd/MBG 微球浸泡入SBF中,3 d后SEM和FTIR觀察微球表面HA的沉積情況(見圖3),考察Nd/MBG微球體外生物活性。結(jié)果表明,所有Nd/MBG 微球未浸泡SBF 前,均表現(xiàn)出規(guī)則的球形形態(tài),分散均勻,表面存在介孔結(jié)構(gòu)。浸泡3 d后,各組Nd/MBG微球表面均有大量HA 生成。其中0 Nd/MBG微球表面HA 呈無規(guī)則的薄片狀,摻雜Nd的Nd/MBG微球表面HA 分布更均勻,且呈三維立體花簇狀。FTIR結(jié)果顯示,0 d 時,Nd 摻雜前后的Nd /MBG微球主要特征峰無明顯變化,表明Nd 的添加不會對MBG的組成和結(jié)構(gòu)造成明顯影響。浸泡3 d后,樣品在507 cm-1處出現(xiàn)了明顯的強(qiáng)峰,對應(yīng)HA 中的P—O—基團(tuán)的特征峰,表明Nd/MBG 微球表面有HA生成,具有生物活性。

    圖3 在SBF中浸泡0和3 d后Nd/MBG微球SEM和FTIR譜圖

    2.3 藥物的裝載釋放

    阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一種蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥物,具有明顯的抑癌作用。但DOX難溶于水且不具有靶向性,體內(nèi)易被P-糖蛋白外排。如果大量使用藥物,可能會引起不良反應(yīng)[16-17]。實(shí)驗(yàn)采用Nd /MBG微球裝載DOX,24 h后0 Nd/MBG微球的裝載率為86.3%,表明Nd/MBG微球能在短時間內(nèi)與溶液中的DOX充分接觸吸附。增加Nd的摻雜量,DOX裝載效率略有所下降,但仍保持在70%左右。表明Nd /MBG微球有良好吸附能力,有利于提高DOX 給藥效率,減少因藥物過量使用而引起的不良反應(yīng)(見表4)。

    裝載DOX的Nd/MBG-DOX微球的釋放行為會受到釋放環(huán)境的影響。不同pH 條件下,Nd/MBG-DOX微球顯現(xiàn)出不同的控制釋放能力。pH =8.6 時,Nd /MBG-DOX微球的最大釋放率為36%,最小釋放率為13%(見圖5(c));pH =7.4 時,最大釋放率為39%,最小釋放率為15%(見圖5(b));pH =4.7 時,最大釋放率高達(dá)82%,最小釋放率為53%(見圖5(a))。相同pH條件下,不同Nd 摻雜比的Nd/MBG-DOX 微球DOX累計(jì)釋放率不同。pH =8.6 時,0 Nd/MBG-DOX微球在25 h內(nèi)釋放率達(dá)到30%,250 h后到40%。摻雜Nd后釋放率降低,其中1 Nd/MBG-DOX 微球累計(jì)釋放量最低,250 h 后為15%(見圖5(c))。pH =4.3時,各組摻雜Nd的Nd/MBG-DOX微球在最初25 h內(nèi)都能快速釋放DOX,并隨著時間延長顯示出良好的控制釋放能力。250 h 后,0.5,1,2 Nd/MBG-DOX 累計(jì)釋放率分別達(dá)為70%、60% 和58%(見圖5(a))。Higuchi模型計(jì)算Nd/MBG-DOX 微球的DOX 累計(jì)釋放量。相同Nd摻雜比的Nd/MBG-DOX微球,DOX在不同pH環(huán)境中的釋放量順序?yàn)閜H =4.3 >pH =7.4>pH =8.6。相同pH 條件下,DOX 動力學(xué)釋放速度順序有所不同。pH =8.6 時,0 Nd/MBG-DOX >0.5 Nd/MBG-DOX >2 Nd/MBG-DOX >1 Nd/MBG-DOX;pH =7.4 時,0 Nd/MBG-DOX >2 Nd/MBG-DOX >1 Nd/MBG-DOX >0.5 Nd/MBG-DOX;pH =3.4 時,0 Nd/MBG-DOX >1 Nd/MBG-DOX >0.5 Nd/MBG-DOX>2 Nd/MBG-DOX。表明Nd/MBG-DOX 微球在不同pH值下具有差異化的延遲釋放能力,在遞送過程中有利于DOX在腫瘤部位的積累,減少耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。

    圖4 Nd/MBG微球裝載DOX的效率

    圖5 Nd/MBG-DOX 微球在不同pH 溶液中DOX 的累計(jì)釋放曲線及Higuchi釋放模型

    2.4 細(xì)胞活力

    采用CCK-8 試劑盒檢測不同濃度的Nd/MBG 和Nd/MBG-DOX微球?qū)G63 細(xì)胞生長的影響。當(dāng)濃度50 μg/mL,1 d 時各Nd/MBG 微球組的OD 值基本與control組持平,表明Nd/MBG微球能夠支持細(xì)胞生長。Nd/MBG-DOX組OD值略小于Nd/MBG組,表明Nd/MBG-DOX微球能夠釋放DOX,影響MG63 細(xì)胞的生長。3 d時,各Nd/MBG微球組的OD值較第1 d都有所上升,表明該濃度下細(xì)胞生長良好。而Nd/MBGDOX組OD 值低于各Nd/MBG 組,且存在顯著性差異。5 d時,Nd/MBG微球組生長趨勢與前3 天類似,說明該濃度下Nd/MBG 微球能夠支持MG63 細(xì)胞生長,細(xì)胞毒性小。Nd/MBG-DOX 微球能釋放DOX,明顯抑制MG63 細(xì)胞的增殖(見圖6(a))。當(dāng)濃度為100 μg/mL 時,在培養(yǎng)初期,各Nd/MBG 組對細(xì)胞的增殖沒有產(chǎn)生明顯的影響,表明該濃度下Nd/MBG 微球仍能夠支持MG63 細(xì)胞生長,細(xì)胞毒性較小。Nd /MBG-DOX組細(xì)胞生長趨勢也與濃度50 μg/mL 時相似,說明Nd/MBG-DOX微球釋放的DOX能抑制MG63細(xì)胞的增殖。隨著培養(yǎng)時間的延長,1 Nd/MBG 微球在第5 d時表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的情況(見圖6(b))。當(dāng)濃度增加為200 μg/mL 時,Nd/MBG 微球組的OD值較control組明顯降低,表明濃度過高的Nd/MBG微球有細(xì)胞毒性,不利于細(xì)胞生長。5 d 時,各Nd/MBG微球組的OD值較第1 d 略有所上升,但細(xì)胞毒性明顯。相同條件下,Nd/MBG-DOX 微球能夠釋放DOX,顯著抑制MG63 細(xì)胞生長(見圖6(c))。研究結(jié)果顯示當(dāng)濃度低于100 μg/mL 時,Nd/MBG 微球相對無毒性,是比較安全的載體。Nd/MBG-DOX 微球能夠緩慢控制藥物釋放,起到抑制癌細(xì)胞生長的作用。

    圖6 不同濃度的Nd/MBG 微球和Nd/MBG-DOX 微球?qū)G63細(xì)胞活力的影響(1:空白對照樣;2:0Nd/MBG;3:0.5Nd/MBG;4:1Nd/MBG;5:2Nd/MBG;6:0Nd/MBGDOX;7:0.5Nd/MBG-DOX;8:1Nd/MBG-DOX;9:2Nd/MBG-DOX)(a):50 μg/mL,(b):100 μg/mL,(c):200 μg/mL(*:P <0.05,**:P <0.01)

    3 結(jié) 語

    本實(shí)驗(yàn)采用溶膠-凝膠法制備不同Nd 摻雜比的Nd/MBG微球,大小均勻,表面存在微小的納米孔隙。通過改變Nd 摻雜比,可以調(diào)控Nd/MBG 微球的表面形貌特征。其中,1 Nd/MBG 微球具有更大的比表面積、平均孔徑和孔體積。Nd/MBG 微球能夠體外礦化生成HA,具有生物活性。Nd/MBG 微球能夠裝載DOX,且在不同pH 環(huán)境下表現(xiàn)出差異化的延遲釋放能力。相同Nd摻雜比的Nd/MBG-DOX微球,在pH =4.3 環(huán)境中的累積釋放量最大。不同Nd 摻雜比的微球,pH =3.4 時,2 Nd/MBG-DOX 的延遲釋放能力最強(qiáng)。體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示,Nd/MBG 微球?qū)G63骨肉瘤細(xì)胞的生物安全性具有劑量依賴性。當(dāng)濃度低于100 μg/mL 時,細(xì)胞培養(yǎng)時表現(xiàn)出較高的安全性。Nd/MBG-DOX微球能夠控制DOX 的釋放,在遞送過程中有利于DOX在腫瘤部位的積累,減少耐藥現(xiàn)象的發(fā)生。研究結(jié)果表明,通過改變Nd 摻雜比調(diào)控制備的Nd/MBG微球,具有良好的藥物控釋能力和生物安全性,在藥物載體領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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