益生菌干預(yù)糖耐量異常向2型糖尿病轉(zhuǎn)化的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照臨床研究

晏 群 李 栩 李沛城 馮 波

2013年流行病學(xué)調(diào)查的數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)成人糖尿病患病率為11.6%，糖尿病前期患病率高達(dá)50.1%[1]；近期中國(guó)成人糖尿病和糖尿病前期的患病率分別為12.8%和35.2%[2]，提示我國(guó)糖尿病患者呈快速增多趨勢(shì)，積極預(yù)防刻不容緩。與正常葡萄糖耐量(normal glucose tolerance，NGT)人群相比，糖尿病前期，尤其是葡萄糖耐量異常(impaired glucose tolerance，IGT)者患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的風(fēng)險(xiǎn)更高。對(duì)IGT人群進(jìn)行早期干預(yù)可顯著降低其罹患T2DM的概率。有效的干預(yù)措施包括改變生活方式和藥物治療?，F(xiàn)已證實(shí)，生活方式的改變能有效預(yù)防IGT發(fā)展為T2DM。二甲雙胍、α-葡萄糖苷酶抑制劑和噻唑烷二酮類等藥物治療也被證實(shí)可預(yù)防IGT發(fā)展為T2DM[3-5]。然而，在臨床實(shí)踐中，自然人群中非糖尿病患者使用降糖藥物降低糖尿病發(fā)生率的依從性相對(duì)較差。因此，在改變生活方式的基礎(chǔ)上，以非降糖藥物來預(yù)防糖尿病前期患者向T2DM發(fā)展，成為了研究的新方向。

糖尿病患者存在腸道菌群的改變，而腸道菌群失調(diào)與糖代謝異常的發(fā)生密切相關(guān)[6-7]。糖尿病患者腸道益生菌群減少，人為補(bǔ)充益生菌能否緩解和改善糖代謝異常？目前已有的關(guān)于補(bǔ)充益生菌治療代謝性疾病的臨床證據(jù)有限，且結(jié)果不一致[8-14]，而上述研究的干預(yù)時(shí)間均較短，可能無法觀察到益生菌的效果。本研究旨在探討補(bǔ)充益生菌對(duì)預(yù)防IGT患者向T2DM轉(zhuǎn)化的有效性和安全性，以及益生菌對(duì)胰島素敏感性、代謝變量和不良事件發(fā)生的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2014年9月—2016年9月在同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院內(nèi)分泌科門診初步篩查為IGT的患者106例，經(jīng)口服75 g葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test, OGTT)明確為IGT的患者77例，其中男33例、女44例；年齡范圍35～65歲，年齡為(55.8±11.9)歲。所有患者治療期間均不使用治療IGT的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有嚴(yán)重肝、腎、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)疾??；②已確診糖尿??；③對(duì)益生菌藥物及其組成成分過敏；④懷疑或有酒精、藥物濫用史；⑤近3個(gè)月參加過其他臨床試驗(yàn)觀察。根據(jù)WHO 1999年[15]的標(biāo)準(zhǔn)診斷IGT、T2DM和NGT。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核和批準(zhǔn)(倫理號(hào)為2013-009)，所有患者均簽署知情同意書，且在中國(guó)臨床試驗(yàn)研究網(wǎng)注冊(cè)(臨床試驗(yàn)注冊(cè)號(hào)：CHICTRC13004024)。

1.2 方法 本研究為隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照試驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將IGT患者分入益生菌組(44例)和安慰劑組(33例)。益生菌組給予益生菌(含雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌)口服，2次/d，每次2粒；安慰劑組給予安慰劑(主要成分為淀粉，外包裝與益生菌完全相同)口服，2次/d，每次2粒。益生菌和安慰劑均為上海信誼制藥公司產(chǎn)品。兩組均隨訪2年，第1年每3個(gè)月和第2年每4個(gè)月進(jìn)行75 g OGTT，評(píng)估患者的糖代謝狀況。所有患者均于干預(yù)前采集完整病史，包括近3個(gè)月內(nèi)所有服用的藥物；分別于干預(yù)前和干預(yù)后(隨訪結(jié)束時(shí))進(jìn)行體格檢查，測(cè)量血壓、心率、身高、腰圍、體重等；75 g OGTT和同步胰島素釋放試驗(yàn)均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行，空腹采血測(cè)定血脂水平、肝腎功能等。收集所有患者干預(yù)前、后糞便標(biāo)本(益生菌組26對(duì)，安慰劑組24對(duì))進(jìn)行腸道菌群測(cè)定。

1.3 腸道菌群檢測(cè) 應(yīng)用16S rDNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腸道菌群結(jié)構(gòu)的組成及豐度。使用上游引物338F(5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’)和下游引物806R(5’-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3’)對(duì)16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；厥誔CR產(chǎn)物，應(yīng)用Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺(tái)(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 觀察終點(diǎn) 主要終點(diǎn)為隨訪2年內(nèi)兩組間T2DM累積發(fā)生率的差異。次要終點(diǎn)為兩組間NGT患者比例，F(xiàn)BG、服糖后30 min血糖(30mPG)、服糖后2 h血糖(2hPG)水平，空腹胰島素(FINS)、服糖后30 min胰島素(30mINS)、服糖后2 h胰島素(2hINS)水平，血脂水平和體重的變化，以及益生菌的安全性，可能的菌群比例的變化。

腸道菌群數(shù)據(jù)處理：應(yīng)用Fastp軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)用Flash軟件進(jìn)行拼接，使用UPARSE軟件根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類并剔除嵌合體。應(yīng)用RDP classifier(version 2.2)對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。組間及組內(nèi)菌群的比較采用秩和檢驗(yàn)，校正P<0.013為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組干預(yù)前基線資料比較 兩組間患者的年齡、男性患者比例、BMI、腰圍、心率、收縮壓、舒張壓，ALT、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、TG、TC、HDL-C、LDL-C、FBG、2hPG、FINS水平，以及HbA1c、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。

表1 兩組患者干預(yù)前基線資料的比較

2.2 兩組干預(yù)后(隨訪結(jié)束時(shí))臨床資料比較 在隨訪過程中，益生菌組有3例患者提前退出(2例因長(zhǎng)期外出不能參加隨訪，1例餐前有低血糖癥狀)，安慰劑組有2例患者提前退出(1例頭痛,1例腹瀉)，總脫落率為6.5%。益生菌組、安慰劑組分別有41、31例患者完成隨訪，納入分析集。干預(yù)后(隨訪結(jié)束時(shí))，益生菌組患者BMI顯著大于安慰劑組(P=0.018)。兩組間其他臨床資料和新發(fā)T2DM、NGT患者比例的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表2。

表2 兩組患者干預(yù)后(隨訪結(jié)束時(shí))臨床資料和新發(fā)T2DM、NGT患者比例的比較

2.3 Kaplan-Meier生存曲線分析 益生菌組隨訪2年內(nèi)的T2DM累積發(fā)生率為48.9%， 安慰劑組為41.9%，兩組間T2DM累積發(fā)生率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.861)。見圖1。

圖1 兩組隨訪2年內(nèi)T2DM累積發(fā)生率的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 兩組干預(yù)前后血糖、胰島素和血脂水平比較 與干預(yù)前相比，兩組患者干預(yù)后(隨訪結(jié)束時(shí))的FBG水平顯著降低[(5.7±0.7) mmol/L 比(5.4±0.7) mmol/L,P=0.001],30mINS水平顯著升高[53.2(37.3,63.3) mU/L比59.2(46.1,75.9) mU /L,P=0.020]，2hINS水平有所降低[98.7(74.9,116.2) mU/L比70.5(61.2,87.5) mU/L，P=0.05]，30mPG、2hPG和FINS水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。兩組間干預(yù)前后血糖、胰島素、HOMA-IR、TG、TC、HDL-C、LDL-C變化值的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表3。

表3 兩組干預(yù)前后血糖、胰島素及其他代謝指標(biāo)變化值的比較 [M(P25，P75)]

2.5 兩組干預(yù)前后腸道菌群變化 組間比較：干預(yù)前,益生菌組與安慰劑組組間優(yōu)勢(shì)菌群(相對(duì)豐度前15的菌屬) [如霍氏真桿菌屬(Eubacterium

hallii)、Blautia屬、Subdoligranulum屬等]所占比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.013)，僅劣勢(shì)菌群瘤胃球菌屬(Ruminococcusgauvreauii)所占比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=-0.21，95%CI為-0.53～0.03，P=0.001)。干預(yù)后，益生菌組與安慰劑組組間優(yōu)勢(shì)菌群[如雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、霍氏真桿菌屬、Blautia屬等]所占比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.013)，僅劣勢(shì)菌群卡氏伯克霍爾德菌-副伯克霍爾德菌屬(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，OR=0.50，95%CI為-3.20～5.12，P=0.012)、產(chǎn)丁酸菌屬(Alistipes，OR=-0.22，95%CI為-0.37～0.09，P=0.007)所占比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組內(nèi)比較：與同組干預(yù)前相比，益生菌組干預(yù)后優(yōu)勢(shì)菌群各菌屬所占比例的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.013)，僅劣勢(shì)菌群乳桿菌屬(Lactobaciuus，OR=0.23，95%CI為-0.70～1.41，P=0.012)、挑剔真桿菌屬(Eubacteriumeligens，OR=0.09，95%CI為0.01～0.21，P=0.012)所占比例顯著增高。安慰劑組干預(yù)前與干預(yù)后各菌屬所占比例的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.013)。見圖2。

A 兩組干預(yù)前菌群占比比較 B 兩組干預(yù)后菌群占比比較 C 益生菌組干預(yù)前后菌群占比比較 D 安慰劑組干預(yù)前后菌群占比比較圖2 兩組干預(yù)前后組間及組內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群占比比較

2.6 Cox回歸分析IGT向T2DM轉(zhuǎn)化的影響因素 以是否行益生菌干預(yù)、年齡、BMI、腰圍、血壓、肝功能、血脂、HOMA-IR為協(xié)變量，納入Cox回歸模型分析，結(jié)果顯示，益生菌干預(yù)(HR=0.98，95%CI為0.39～2.46)、年齡(HR=1.00，95%CI為0.97～1.04)、BMI(HR=0.91，95%CI為0.74～1.13)、腰圍(HR=1.01，95%CI為0.95～1.08)、收縮壓(HR=1.02，95%CI為1.00～1.05)、舒張壓(HR=0.95，95%CI為0.90～1.01)、ALT(HR=1.01，95%CI為0.99～1.03)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(HR=1.00，95%CI為0.99～1.01)、TG(HR=1.67，95%CI為0.63～4.46)、TC(HR=0.23，95%CI為0.01～4.13)、HDL-C(HR=3.42，95%CI為0.25～47.60)、LDL-C(HR=4.42，95%CI為0.24～80.20)、HOMA-IR(HR=1.09，95%CI為0.96～1.23)均不是IGT向T2DM轉(zhuǎn)化的影響因素(P值均>0.05)。

2.7 兩組不良反應(yīng)情況比較 安慰劑組、益生菌組不良反應(yīng)發(fā)生率分別為9.1%(3/33)、0，兩組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.075)。安慰劑組發(fā)生不良反應(yīng)的3例患者中，1例訴服藥后頭痛，停藥后自行好轉(zhuǎn)；1例訴服藥后腹瀉1周，停藥后好轉(zhuǎn)；1例因白內(nèi)障手術(shù)住院治療，好轉(zhuǎn)后出院。

3 討 論

腸道菌群失調(diào)與肥胖、糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其表現(xiàn)為腸道菌群豐度減少、擬桿菌門增多，以及厚壁菌門減少、細(xì)菌代謝產(chǎn)物丁酸鹽減少等[6-7]。腸道菌群受飲食、藥物、年齡、性別等多種因素影響。來自人類和動(dòng)物的研究[16-18]結(jié)果表明，腸道微生物組是介導(dǎo)減肥手術(shù)、飲食控制和降糖藥物治療效果的共同途徑。因此，重塑腸道菌群可能是人類防治糖尿病的一個(gè)新的研究方向。本研究通過補(bǔ)充包含有雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的活性益生菌或安慰劑對(duì)IGT患者進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，益生菌組與安慰劑組的T2DM累積發(fā)生率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示益生菌在預(yù)防IGT向T2DM轉(zhuǎn)化方面并不占優(yōu)勢(shì)。

益生菌可能對(duì)宿主有多種影響，包括促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如乳糖)的消化和代謝，或通過膽鹽產(chǎn)生全身效應(yīng)，直接或間接抵抗病原體，改善腸道屏障功能，改變微生物組結(jié)構(gòu)和神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)，進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)等[19]。關(guān)于益生菌或益生元改善代謝相關(guān)指標(biāo)的研究較多但結(jié)論不一?？诜人崛闂U菌和雙歧桿菌的益生菌酸奶可改善T2DM患者的FBG、HbA1c水平和抗氧化狀態(tài)[8]。另有兩項(xiàng)研究[9-10]結(jié)果表明，合生元或益生菌干預(yù)僅改善T2DM或妊娠期糖尿病患者的脂質(zhì)代謝，并不能改善FBG水平。近期發(fā)表的一項(xiàng)研究[20]結(jié)果表明，單純給予益生菌干預(yù)12周，T2DM患者的HbA1c無改善。在關(guān)于補(bǔ)充益生菌或益生元對(duì)糖尿病前期患者血糖的研究[11-14]中，均未發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充益生菌可改善血糖水平或HOMA-IR。日本學(xué)者對(duì)48例肥胖的糖尿病前期男性患者予口服含干酪乳桿菌菌株牛奶8周后發(fā)現(xiàn),服用益生菌牛奶可降低患者TC、LDL-C及非HDL水平，但未改善2hPG[11]。北歐學(xué)者對(duì)21例超重或肥胖的糖尿病前期患者予低聚半乳糖補(bǔ)充治療12周，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充低聚半乳糖顯著增加了腸道雙歧桿菌含量，但仍未顯著改善HOMA-IR[12]。在一項(xiàng)關(guān)于青少年糖尿病前期患者的研究[13]中,未觀察到口服益生菌4個(gè)月后可改善FBG和HbA1c。新西蘭學(xué)者通過對(duì)33例糖尿病前期患者予間歇斷食和補(bǔ)充乳桿菌或安慰劑12周后，未觀察到補(bǔ)充乳桿菌組患者FBG、HbA1c及血脂代謝指標(biāo)(TC、TG、HDL-C、LDL-C)有改善[14]。但上述這些研究的觀察時(shí)間均較短，是否會(huì)影響益生菌的有效性尚待驗(yàn)證。在本研究中，雖然在隨訪結(jié)束時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)所有受試者在服糖后胰島反應(yīng)功能有所改善，但兩組間FBG及服糖后的血糖、胰島素水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，本研究結(jié)果顯示，隨訪結(jié)束時(shí)兩組間TC、TG、HDL-C、LDL-C變化的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這可能與菌株和配方的使用不一致、目標(biāo)人群的異質(zhì)性、飲食結(jié)構(gòu)，以及腸道菌群結(jié)構(gòu)不完全一致有關(guān)。

本研究中的腸道菌群結(jié)果分析提示，益生菌組干預(yù)后較干預(yù)前乳桿菌屬占比顯著增高，而安慰劑組干預(yù)后較干預(yù)前各菌屬占比的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示，補(bǔ)充益生菌能一定程度地改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。本研究中未發(fā)現(xiàn)兩組間干預(yù)后菌群的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究選取的糞便樣本量較小、同一組內(nèi)樣本個(gè)體差異較大，以及飲食等其他因素影響有關(guān)。此外，在干預(yù)后，兩組卡氏伯克霍爾德菌-副伯克霍爾德菌等與土壤發(fā)酵相關(guān)的菌屬存在一定的差異，考慮與標(biāo)本取材及保存的質(zhì)量控制有一定的相關(guān)性。

本研究是首次通過在中國(guó)人群探討益生菌干預(yù)IGT向T2DM轉(zhuǎn)化，且為期較長(zhǎng)的隨機(jī)安慰劑對(duì)照研究，但本研究存在一定的局限性。首先，本研究采用的益生菌補(bǔ)充劑對(duì)中國(guó)受試者的研究結(jié)果，并不能代表其他菌株對(duì)其他人群或人種的影響。其次，本研究未記錄受試者的生活方式，如飲食及運(yùn)動(dòng)情況，而生活方式可能會(huì)對(duì)血糖的轉(zhuǎn)歸有一定影響，但研究設(shè)計(jì)的安慰劑對(duì)照可最大程度彌補(bǔ)相關(guān)影響。最后，本研究納入的樣本量相對(duì)較小，使得檢驗(yàn)兩組率差異的統(tǒng)計(jì)效能偏低。

綜上所述，予IGT患者補(bǔ)充雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的活性益生菌是安全的，但不能降低IGT向T2DM轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。盡管如此，仍有必要探索不同益生菌菌種對(duì)IGT的效應(yīng)。