麥胚谷胱甘肽提取與含量測(cè)定方法研究

劉 千 陳 黎 胡用軍 葉鳳琴 陳 強(qiáng)

麥胚谷胱甘肽提取與含量測(cè)定方法研究

劉 千1陳 黎2胡用軍2葉鳳琴2陳 強(qiáng)3

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院1，溫江 611130)
(宜賓市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所2，宜賓 644002)
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院3，雅安 625014)

旨在建立用反相高效液相色譜(RP－HPLC)法同時(shí)檢測(cè)小麥胚中谷胱甘肽(glutathione)還原型(G－SH)和氧化型(G－S－S－G)含量的方法。為了更高效地提取谷胱甘肽，在水作溶劑條件下，考察了不同浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間、料液比、超聲溫度、溶劑pH和沉淀劑比例對(duì)谷胱甘肽提取效率的影響。并在2種色譜柱上，考察了5種流動(dòng)相下谷胱甘肽含量測(cè)定結(jié)果。最終確定最適提取條件為:提取溶劑pH 4．0，料液比1∶30，浸泡1 h后在0℃下超聲10 min，沉淀劑比例為1∶2．0;色譜條件為:Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm);流動(dòng)相:水(0．08%辛烷磺酸鈉+0．24%磷酸二氫鈉，以磷酸調(diào)pH 2．5)－乙腈(體積比為82∶8);檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;流速為1．0 mL·min－1;柱溫為25℃。測(cè)定了19份不同來源麥胚中谷胱甘肽的含量，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽含量差異顯著，最高達(dá)180．71 mg·(100 g)－1。

麥胚 谷胱甘肽 提取 含量

谷胱甘肽(glutathione)是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)經(jīng)肽鍵縮合而成的活性三肽，有還原型(G－SH)和氧化型(G－S－S－G)2種形態(tài)，在生理?xiàng)l件下以還原型占絕大多數(shù)。國(guó)外早在20世紀(jì)二三十年代就開始了對(duì)其生理功能的研究［1］。它能保護(hù)生物膜、抗衰老、解毒、抗癌、預(yù)防動(dòng)脈硬化及抑制飲酒過度而引起的脂肪肝，也是細(xì)胞內(nèi)主要還原型物質(zhì)，能保護(hù)細(xì)胞免受氧化及有毒物質(zhì)的損傷［2］。隨著對(duì)谷胱甘肽研究的深入，其在食品［3－4］、醫(yī)學(xué)［2］、保?。?－6］、抗衰老［7］等方面的應(yīng)用正日益引起人們的廣泛關(guān)注。谷胱甘肽作為功能活性因子，是制作功能性食品的理想添加劑［3］。

目前，食品工業(yè)中已廣泛使用抗氧化劑，但絕大多數(shù)屬人工合成，隨著人們?cè)絹碓疥P(guān)心食品安全問題，天然谷胱甘肽的強(qiáng)抗氧化活性和高安全性，在保健食品等領(lǐng)域?qū)⒂袠O好的應(yīng)用前景［8］。而谷胱甘肽在自然界含量豐富，尤其在小麥胚中含量最多，高達(dá)0．47%［9］。當(dāng)前，對(duì)麥胚營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、功能特性和麥胚穩(wěn)定化技術(shù)以及麥胚應(yīng)用的研究較多，但關(guān)于麥胚中谷胱甘肽含量測(cè)定方法研究較少，僅見曹新志等［10］采用熒光法進(jìn)行。麥胚中谷胱甘肽的提取方法有劉國(guó)琴等［11］用浸提法，周惠明等［12］用離子交換分離法，盧敏等［13］用高壓電脈沖法，尚未見用超聲提取法。

目前，常見的測(cè)定其他植物或食品中谷胱甘肽含量包括紫外分光光度法、酶法、熒光光度法、電化學(xué)法和高效液相色譜法等［5－6，14－16］。其中，高效液相色譜法因具有靈敏性高，專一性強(qiáng)，線性范圍寬，穩(wěn)定性較高等特點(diǎn)應(yīng)用范圍越來越廣。

本研究比較了不同浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間、料液比、超聲溫度、溶劑pH和沉淀劑比例對(duì)谷胱甘肽提取效率的影響，力求更高效地從小麥胚中提取谷胱甘肽，并建立同時(shí)測(cè)定小麥胚中GSH和GSSG含量的HPLC法，為麥胚功能性食品方面的開發(fā)和麥胚中谷胱甘肽的提取、測(cè)定提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 供試材料

19份不同來源小麥生/熟胚為供試樣品，樣品編號(hào)及來源見表1。樣品粉碎過40目篩后烘干保存?zhèn)溆?。選取1號(hào)材料進(jìn)行提取條件和色譜條件試驗(yàn)。

表1 供試材料19份小麥胚的來源

1．2 儀器與試劑

KQ－100B超聲波清洗機(jī):昆山超聲波儀器公司;UV－265型紫外－可見分光光度儀、高效液相色譜儀［SPD－10A VP紫外－可見檢測(cè)器、LC－6A高壓泵、CTO－10AS VP柱溫箱(含7725i型手動(dòng)進(jìn)樣器)，浙大智達(dá)N2000工作站］:Shimadzu公司;CP225D型電子天平:Sartorius公司;Milli－Q型純水儀:Millipore公司。

GSH和GSSG對(duì)照品:Sigma公司;辛烷磺酸鈉:上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;色譜純乙腈、分析純磷酸二氫鈉、氯仿等其余試劑:成都市科龍化工試劑廠。

1．3 供試品溶液的制備

按表2中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)順序逐一進(jìn)行單因素試驗(yàn)?？疾旖輹r(shí)間時(shí)，其他因素取中間變量值;最佳浸泡時(shí)間確定后，采用確定的條件考察超聲時(shí)間，未考察因素則取中間變量值;以此類推，各設(shè)3次重復(fù)。精密稱取1 g麥胚粉于100 mL具塞三角瓶中，加入蒸餾水并小幅度振蕩均勻，稱定三角瓶和溶液的總質(zhì)量，在暗室中放置一定時(shí)間后取出。將樣液放在特定溫度的水中用超聲波提取樣品一定時(shí)間之后，擦凈外壁再次稱量并按先前稱定的總質(zhì)量補(bǔ)加提取溶劑。吸取溶液0．5 mL至1．5 mL離心管中，按比例加入沉淀劑氯仿，于10 000 r/min下離心15 min。吸取上清液10μL進(jìn)行HPLC測(cè)定。

表2 各單因素和其變量值

1．4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取GSH、GSSG對(duì)照品，配制濃度分別為7．72μg/mL與8．64μg/mL、15．44μg/mL與17．28 μg/mL和30．88μg/mL與34．56μg/mL的GSH∶GSSG對(duì)照品混合溶液。

1．5 色譜條件和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別在色譜柱:Synergi 4μHydro－RP 8 nm，150×4．6 mm和Synergi 4μFusion－RP 8 nm，150×4．6 mm上考查了5種流動(dòng)相對(duì)GSH和GSSG分離的影響。其中流動(dòng)相Ⅰ(水－乙腈)考察比例為:99∶1，98∶2，97∶3;流動(dòng)相Ⅱ(辛烷磺酸鈉+磷酸二氫鈉混合溶液－乙腈)考察比例為:92∶8，93∶7，94∶8，95∶5，90∶10，Ⅰ和Ⅱ均用磷酸調(diào)節(jié)pH為2．5、3．0和3．5。綜合考慮分離度、理論塔板數(shù)和分析時(shí)間，選擇色譜柱:Synergi 4μFusion－RP 8 nm，150×4．6 mm;流速為1．0 mL·min－1;柱溫25℃;進(jìn)樣量為10μL;流動(dòng)相:水(0．08%辛烷磺酸鈉+0．24%磷酸二氫鈉，以磷酸調(diào)pH 2．5)－乙腈(體積比為82∶8);檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm的色譜條件。此色譜條件下，理論塔板數(shù)以GSH和GSSG的峰計(jì)算均不低于4 000，如圖1所示。

圖1 對(duì)照品色譜圖

2 結(jié)果與討論

2．1 谷胱甘肽提取條件選擇

谷胱甘肽的超聲波提取條件單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 超聲波提取條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

各數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間、物料比和提取溫度各變量間差異達(dá)到極顯著，溶劑pH差異不顯著，沉淀劑比例差異顯著。單因素試驗(yàn)的最佳條件為:浸泡時(shí)間1 h、超聲時(shí)間10 min、物料比1∶30、提取溫度0℃、沉淀劑比例1∶2．0;考慮到用提取溶劑溶解樣品時(shí)，溶劑pH對(duì)谷胱甘肽含量影響不大，由于小麥胚芽蛋白的等電點(diǎn)為pH 4．0，利于后面蛋白質(zhì)的除雜，所以采用4．0作為最佳pH值。

劉國(guó)琴等［11］曾報(bào)道85℃浸提GSH得率最高。但本研究之前按其方法在60～90℃每間隔10℃提取，并用碘量法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)此條件下，GSH峰與雜質(zhì)峰重合使測(cè)定的GSH峰面積偏高很多。經(jīng)重新建立色譜條件將兩峰分離后發(fā)現(xiàn)，增加溫度僅使雜質(zhì)峰增大，而GSH峰面積基本不變。故在此溫度段，增加超聲溫度對(duì)提高GSH的提取無顯著效果，考慮到浸提與超聲提取的差異，后續(xù)試驗(yàn)中只考察了0、25和50℃。物料比的選擇上，劉國(guó)琴等［11］和盧敏等［13］分別采用了1∶9和1∶20的物料比，陳麗娜等［14］提取玉米胚中谷胱甘肽用的物料比是1∶10，而本試驗(yàn)中的最佳物料比為1∶30。這可能是由于劉國(guó)琴等［14］采用的是攪拌浸提，盧敏等［13］采用高壓電脈沖，而陳麗娜等［14］則是對(duì)玉米胚進(jìn)行先超聲(時(shí)間5 s/次，超聲次數(shù)30次，間隔時(shí)間5 s)后振蕩的提取，提取方法和原料不同導(dǎo)致差異。針對(duì)浸泡時(shí)間因素，還進(jìn)行了4、8、12 h的試驗(yàn)，超聲時(shí)間進(jìn)行了40 min和50 min的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽含量都較低，因此后續(xù)試驗(yàn)未進(jìn)一步考察。

2．2 色譜條件方法學(xué)考察

2．2．1 線性關(guān)系

取GSH、GSSG濃度分別為7．72、8．64μg/mL的對(duì)照品混合溶液，進(jìn)樣1、5、10、15、20μL，濃度分別為15．44、17．28μg/mL的對(duì)照品混合溶液，進(jìn)樣12．5、15、17．5、20μL，再取濃度分別為30．88、34．56μg/mL的對(duì)照品混合溶液，進(jìn)樣12．5、15、17．5、20μL，按“1．5”所述色譜條件測(cè)定。分別以GSH和GSSG峰面積為縱坐標(biāo)，GSH和GSSG進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到回歸方程如下:

GSH的回歸方程為:Y=620 490X+742

R=0．999 8

GSSG的回歸方程為:Y=777 678X+110 8

R=0．999 5

以上結(jié)果表明GSH和GSSG在0．007 7～0．617 6 μg和0．008 6～0．691 2μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2．2．2 精密度

精密吸取GSH和GSSG的對(duì)照品混合溶液5μL，重復(fù)進(jìn)樣6次。得到GSH峰面積分別為:261 385、265 444、261 942、266 128、261 042和265 159，RSD為0．87%;GSSG峰面積分別為:332 281、333 540、332 286、327 274、326 7337和333 765，RSD為0．95%。表明進(jìn)樣精密度良好。

2．2．3 穩(wěn)定性

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)表明［4］，GSH水溶液在空氣中易被氧化，可加入具有強(qiáng)還原性的物質(zhì)如維生素C等保護(hù)其不被氧化。因此本次試驗(yàn)通過對(duì)對(duì)照品加VC和不加VC考察了其穩(wěn)定性。分別吸取不加VC的GSH和GSSG的對(duì)照品混合溶液5μL，連續(xù)6 d內(nèi)每天進(jìn)樣1次測(cè)定，結(jié)果混合標(biāo)樣中GSH和GSSG峰面積RSD分別為2．25%和2．58%;再分別吸取加VC的GSH和GSSG的對(duì)照品混合溶液5μL，連續(xù)6天內(nèi)每天進(jìn)樣1次測(cè)定，結(jié)果混合標(biāo)樣中GSH和GSSG峰面積RSD分別為3．03%和0．26%?？梢钥闯?，加VC和不加VC對(duì)對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性在6 d內(nèi)沒影響，且具有良好的穩(wěn)定性。因此，選用不加VC的對(duì)照品溶液。

2．2．4 重復(fù)性

稱取供試品6份，按“1．3”制備，測(cè)得GSH含量分別為35．01、34．35、34．40、33．49、32．62和32．45 mg/100 g，平均含量為(33．72±1．03)mg/100 g，RSD為3．08%;該供試樣品中未檢出GSSG。

2．2．5 加樣回收率

精密稱取1 g樣品，加入GSH和GSSG標(biāo)樣并按“1．3”制備后測(cè)定。GSH與GSSG各自的加入量、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差列于表3。由表3可知，GSH在3個(gè)不同加入量下的回收率分別為94．80%、102．00%和96．09%，平均回收率為97．63%，RSD為3．93%;GSSG在3個(gè)不同加入量下的回收率平均值則分別為94．25%、102．10%和94．56%，平均回收率為96．97%，RSD為4．59%。結(jié)果表明GSH和GSSG的回收良好。

表3 GSH和GSSG的回收率

2．3 19份麥胚樣品的測(cè)定

不同來源的19份小麥胚樣品中谷胱甘肽含量測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 19份小麥胚中谷胱甘肽含量/mg·(100 g)－1

測(cè)定條件:提取溶劑pH 4．0，料液比1∶30，浸泡時(shí)間1 h，在0℃下超聲10 min，沉淀劑比例為1∶2．0;色譜條件為:Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm);流動(dòng)相:水(0．08%辛烷磺酸鈉+0．24%磷酸二氫鈉，以磷酸調(diào)pH 2．5)－乙腈(體積比為82∶8);檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;流速為1．0 mL·min－1;柱溫為25℃。可以看出谷胱甘肽含量范圍在6．58～180．71 mg·(100 g)－1;其中GSH和GSSG含量范圍分別在ND(未檢出)～105．46 mg·(100 g)－1和ND(未檢出)～97．21 mg·(100 g)－1。據(jù)報(bào)道，小麥胚芽中谷胱甘肽含量為98～107 mg·(100 g)－1［15－16］。本研究的含量范圍變幅較大，可能與材料來源有關(guān)，與生熟加工方式無必然聯(lián)系。

3 結(jié)論

通過以上試驗(yàn)可以看出，在最適提取條件下，用Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm)，流動(dòng)相:水(0．08%辛烷磺酸鈉+0．24%磷酸二氫鈉，以磷酸調(diào)pH 2．5)－乙腈(體積比為82∶8)，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速為1．0 mL·min－1，柱溫為25℃，同時(shí)測(cè)定小麥胚中GSH和GSSG，分別在0．007 7～0．617 6μg和0．008 6～0．691 2μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系;進(jìn)樣精密度良好，重復(fù)性和穩(wěn)定性高，回收良好;檢測(cè)的19份不同來源麥胚樣品谷胱甘肽含量差異較大。因此，此法可為麥胚中谷胱甘肽的開發(fā)利用提供一定參考依據(jù)。

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Study on Extraction and Determination Method of Glutathione from Wheat Germ

Liu Qian1Chen Li2Hu Yongjun2Ye Fengqin2Chen Qiang3
(College of Agronomy，Sichuan Agricultural University1，Wenjiang 611130)
(Yibin City Product Quality Supervision and Inspection Institute2，Yibin 644002)
(College of Food Science，Sichuan Agricultural University3，Ya'an 625014)

This study is to establish the RP－HPLC method to determine the content of GSH and GSSG simultaneously．Using distilled water as solvent，the effect of the time of soak，time of ultrasonic extraction，material liquid ratio，temperature of ultrasonic extraction，solvent pH，and precipitating agent proportion on the the extracted efficiency of Glutathione were determined．The contents of glutathione were determined by using 2 chromatogram columniations and 5 mobile phases．Finally，the optimal conditions were determined．The solvent pH was 4．0，the material liquid ratio was 1∶30，the time of soak was 1 h，ultrasonic extraction 10 min in 0℃ ，and precipitating agent proportion was 1∶2．0．Chromatogram conditions were Fusion－RP column(4．60×150 mm，4μm，8 nm)at 25℃ ，the mobile phase were both a mixture of 0．08%octanesulfonic acid sodium salt and 0．24%Sodium dihydrogen phosphate in water and acetonitrile(82∶8，V/V)，adjusted to pH 2．5 with phosphoric acid．The UV detection wavelength was set at 210 nm．The flow rate was 1．0 mL·min－1．The glutathione contents from 19 wheat germs were determined．The glutathione contents had significant difference．The maximal content was 180．71 mg·(100 g)－1．

wheat germ，glutathione，extract，content

S－3

A

1003－0174(2012)10－0104－06

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計(jì)劃博士專項(xiàng)(06070401)

2012－02－02

劉千，女，1981年出生，實(shí)驗(yàn)師，作物遺傳育種

陳黎，男，1979年出生，副教授，生物化學(xué)與分子生物學(xué)