響應面法優(yōu)化花生納豆的發(fā)酵工藝

齊鳳元 李歡歡 楊 利 王國洋 馬 勇

響應面法優(yōu)化花生納豆的發(fā)酵工藝

齊鳳元 李歡歡 楊 利 王國洋 馬 勇

(渤海大學化學化工與食品安全學院，錦州 121013)

以黃豆和花生為原料，制作花生納豆，研究花生納豆的最佳制作工藝條件。通過Plackett－Burman試驗篩選了影響花生納豆發(fā)酵的3個重要因素，即黃豆與花生的質(zhì)量比、接種量、發(fā)酵時間;利用最陡爬坡試驗和Box－Behnken試驗，以感官評價和氨基酸態(tài)氮為指標，確定最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明最佳發(fā)酵條件為黃豆與花生的質(zhì)量比為4∶1，121℃蒸煮30 min，接種量3%，40℃發(fā)酵18 h?；ㄉ{豆的感官品質(zhì)和風味都要優(yōu)于傳統(tǒng)納豆。

花生納豆 發(fā)酵 感官評價 氨基酸態(tài)氮

納豆是日本的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，由納豆芽孢桿菌發(fā)酵蒸煮的黃豆而成，納豆除含黃豆的全部營養(yǎng)外，還含有納豆激酶、超氧化物歧化酶及維生素B12和維生素K2等，使納豆具有獨特的食療作用。納豆富有黏性，其黏性物質(zhì)主要為多糖和γ－多聚谷氨酸［1］。近年來，納豆作為一種功能性食品，逐漸被人們重視。但是傳統(tǒng)納豆均以黃豆為單一原料，口感及風味很難被大多數(shù)中國人接受［2］。為了解決這一問題，有從改善菌種以及添加輔料等方面著手，也有從調(diào)整原料配比來加以改善［3－6］。而以花生和黃豆為原料，制作花生納豆，鮮見有對其進行研究?；ㄉ胸S富的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪，花生中的白藜蘆醇、單不飽和脂肪酸和β谷甾醇等物質(zhì)能抑制血小板非正常凝聚、預防心肌梗塞和腦栓塞等心腦血管疾?。?］，花生一直是功能性食品的重要原料。本試驗以黃豆和花生為原料，制作一種納豆新產(chǎn)品——花生納豆，探討花生納豆的最佳發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1．1 材料與設備

黃豆、花生:均為錦州當?shù)禺a(chǎn);納豆芽孢桿菌:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。LDZX－40SC型立式自控電熱壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;303－6A數(shù)顯電熱保溫箱:上海陽光實驗儀器有限公司;JB－90－2型定時磁力攪拌器:上海衡平儀器儀表廠;BCM－1000A型生物潔凈工作臺:深華生物技術有限公司;L－8800型氨基酸自動分析儀:日立公司。

培養(yǎng)基采用肉湯培養(yǎng)基:牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，加熱溶解后用紗布過濾，用4%NaOH調(diào)pH至7．0～7．4［8］;斜面固體培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂。

培養(yǎng)基均121℃滅菌15 min。

1．2 方法

1．2．1 菌種的活化、保存和擴大培養(yǎng)

將納豆菌菌粉接入肉湯培養(yǎng)基中，40℃培養(yǎng)16～24 h，傳4代至性狀穩(wěn)定;接種至斜面固體培養(yǎng)基保存?zhèn)溆?從斜面挑取1～2環(huán)納豆菌于肉湯培養(yǎng)基中，40℃擴大培養(yǎng)16～24 h，即為納豆芽孢桿菌發(fā)酵液。

1．2．2 工藝流程

1．2．3 操作要點

前處理:選取顆粒飽滿、大小均一、無霉爛和蟲蛀的花生和黃豆，清洗后，與水按質(zhì)量比1∶3分別浸泡14～20 h，水溫為17～20℃，使花生質(zhì)量為浸泡前的1．6倍，黃豆質(zhì)量為浸泡前的2．2倍，瀝干水分。

混合:將泡好的花生剝?nèi)ゼt衣后，將花生與黃豆按質(zhì)量比1∶4混勻，裝入發(fā)酵罐，每罐50 g，用紗布包好。

蒸煮:121℃蒸煮30 min，蒸煮好的花生和黃豆保持豆粒完整。

接種:將蒸煮好的原料自然冷卻到80℃左右，接種納豆芽孢桿菌發(fā)酵液，混勻，用紗布蓋好。

發(fā)酵:將接種后的原料放入恒溫培養(yǎng)箱，濕度大約在50%左右，40℃發(fā)酵約18 h。

后熟:封蓋后于4℃冰箱放置24 h。

1．2．4 感官評定

由本院10名有經(jīng)驗的師生采用雙盲法進行打分。對樣品采用四位隨機數(shù)字進行編碼，樣品排列順序也隨機［9］，評分標準見表1［10］。

表1 感官評分標準

1．2．5 氨基酸態(tài)氮的測定

甲醛滴定法［11］(取納豆黏液為樣品)。

1．2．6 多糖的測定

直接滴定法［12－13］。

1．2．7 氨基酸測定

精確稱取1．000 0 g樣品放入特制的玻璃水解管中，加入6 mol/L HCl 8 mL，抽真空，待真空度達到要求后維持10 min，封口，110℃水解22 h，冷卻。用濾紙過濾，取濾液1 mL于10 mL燒杯中，60℃水浴，在真空干燥器中蒸干。將蒸干的樣品，定量加入一定體積的0．02 mol/LHCl，在空氣中放置30 min，用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸含量［14］。

1．3 數(shù)據(jù)處理

1．3．1 Plackett－Burman試驗

Plackett－Burman試驗從眾多的影響花生納豆發(fā)酵因素中快速有效的篩選出最為重要的幾個因素供進一步研究［15］。N次試驗設計最多可研究N－1個因素，其中至少有3個空白項以估計試驗誤差，每個因素取高低2個水平，高、低水平分別出現(xiàn)N/2次;當某個因素處于高(低)水平時，其余因素各出現(xiàn)高、低水平N/2次。各因素效應進行T檢驗，選擇可信度較高的因素作為重要的因素進行下一步研究［16］。

1．3．2 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗是根據(jù)影響花生納豆發(fā)酵的各顯著因素效應值的大小確定最陡上升路徑，其他因素的取值根據(jù)各因素效應的正負和大小，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值［16－17］。

1．3．3 Box－Behnken試驗

Box－Behnken法每個因素取3個水平，以(－1，0，1)為編碼，對數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得到二次方程，能夠分析各因素的主效應和交互作用，最后在一定的條件下取得最佳值［15］。

2 結(jié)果與討論

2．1 重要因素的篩選

利用Plackett－Burman試驗設計篩選影響感官評分和氨基酸態(tài)氮的重要因素，選取了影響花生納豆發(fā)酵的10個因素，包括黃豆與花生的質(zhì)量比、接種量、蒸煮時間、浸泡時間、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和4個空白因素。每個因素取高低2個水平，高水平是低水平的1．25倍，以感官評分值和氨基酸態(tài)氮為響應值，3次重復試驗，取平均值，結(jié)果見表2;以感官評分值和氨基酸態(tài)氮［18］為響應值的各因素效應、重要性評價，見表3。

表2 N=12的Plackett－Burman試驗設計及響應值表

由表3可知，對花生納豆感官評分值有顯著影響(可信度均大于95%)的因素為黃豆與花生的質(zhì)量比、浸泡時間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和接種量，其中發(fā)酵時間影響最顯著，其次是接種量，兩個因素呈顯著的正效應;對花生納豆氨基酸態(tài)氮含量有顯著影響(可信度均大于95%)的因素按重要性依次為接種量、發(fā)酵時間、黃豆與花生的質(zhì)量比，3者均呈顯著的正效應。

表3 Plackett－Burman試驗因素水平及其主效應分析

2．2 最陡爬坡試驗

結(jié)合表3試驗結(jié)果，利用最陡爬坡試驗確定最佳響應區(qū)域，在下一步試驗中，選取接種量、發(fā)酵時間、黃豆與花生的質(zhì)量比這3個因素，設定它們的變化方向和步長，其他因素取最低水平，試驗結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡試驗設計及結(jié)果

表4列出了各顯著因素的變化方向、步長和試驗結(jié)果。由表4知，感官總分和游離氨基酸態(tài)氮在第2組到第3組之間有一個上升，之后開始下降，第3組和第4組之間存在最優(yōu)條件，所以選取第3組條件為后續(xù)Box－Behnken試驗的中心點。

2．3 最佳發(fā)酵條件的確定

利用Box－Behnken試驗設計選取(－1，0，1)3個編碼水平，分別對應各因素的取值，見表5，試驗結(jié)果見表6。

表5 3因素3水平取值表

根據(jù)表6的Box－Behnken試驗結(jié)果，利用SAS9．1．3軟件對結(jié)果進行二次回歸分析，得到感官評分和氨基酸態(tài)氮對接種量、發(fā)酵時間、黃豆與花生的質(zhì)量比的多元二次回歸方程，同時得到響應面立體分析圖(圖1、圖2)，可知，回歸方程存在穩(wěn)定點。

表6 N=15的Box－Behnken試驗設計

以感官評分為響應值的回歸方程為:

以氨基酸態(tài)氮為響應值的回歸方程為:

模型的顯著性檢驗表明［19］，失擬項大于F值的概率分別為0．195 6和0．074 8，失擬項不顯著，兩模型均顯著，說明模型設計合理。另外，兩組模型的復相關系數(shù)分別為91．55%和90．86%，表明兩模型與實際情況擬合較好。以感官評分為響應值時，通過嶺脊分析得知，當編碼值分別為(0．206 4，－1．218 3，－0．152 9)，即接種量X1為3．10%，發(fā)酵時間X2為16．78 h，黃豆/花生X3為3．85時，感官評分最大為95．14;以氨基酸態(tài)氮含量為響應值時，當編碼值分別為(0．413 47，0．188 45，0．890 80)，即接種量X1為3．21%，發(fā)酵時間X2為18．19h，黃豆/花生X3為4．89，最大值為0．583%。為了檢驗模型的準確性，再次進行驗證試驗，試驗中結(jié)合實際情況取接種量3%，發(fā)酵18 h，黃豆與花生質(zhì)量比4∶1，得到感官評分值為94．65分，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)為0．578%，與預測值接近。

2．4 產(chǎn)品質(zhì)量指標

在最佳發(fā)酵條件下，即黃豆與花生的質(zhì)量比為4∶1，在121℃蒸煮30 min，接種量3%，濕度50%左右，40℃發(fā)酵18 h，得到的花生納豆具有良好的感官品質(zhì)，金黃和乳白的誘人顏色，氣味芳香，黏液量多，拉絲長，口感酥軟。理化指標和游離氨基酸含量見表7和表8。

表7 理化指標

表8 氨基酸含量

續(xù)表

3 討論與結(jié)論

花生納豆的最佳發(fā)酵條件為黃豆與花生的質(zhì)量比為4∶1，121℃蒸煮30 min，接種量3%，濕度50%左右，40℃發(fā)酵18 h，氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分數(shù)為0．583%。

花生納豆具有光澤，氣味芳香，口感酥軟，黏液多，拉絲的長度達10個單位以上，且韌性強。

花生納豆多糖含量高。多糖具有豐富的生物活性，有抗血栓、抗腫瘤、免疫促進和抗病毒等作用［20］，用直接滴定法測定花生納豆多糖質(zhì)量分數(shù)為7．20%，而同樣方法測得傳統(tǒng)納豆多糖質(zhì)量分數(shù)為6．08%。

花生納豆營養(yǎng)及風味、口感均優(yōu)于傳統(tǒng)納豆，適合我國人民的飲食習慣?；ㄉ{豆的開發(fā)，對提高花生、黃豆的附加值，對我國納豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及全民健康都具有積極的意義。

［1］Toshio Hara，Shinichiro Nagatomo，Seiya Ogata．The DNA sequence ofγ －glutamyltranspeptidase gene of bacillus subtilis(natto)plasmid pUH1［J］．Appl Microbiol Biotechnol 1992(37):211－215

［2］衛(wèi)拯友，吳富強，訾靜．鷹嘴豆發(fā)酵生產(chǎn)納豆初探［J］．陜西農(nóng)業(yè)科學，2009(6):64－66

［3］齊鳳元，金麗杰．薏米納豆的開發(fā)［J］．中國調(diào)味品，2005(10):19－21

［4］楊華松，張曉冬，阮梅杰，等．黑豆納豆發(fā)酵工藝的研究［J］．江蘇調(diào)味副食品，2009，26(5):19－22

［5］邵偉，熊澤，黎姝華，等．納豆口味改進初探［J］．中國調(diào)味品，1999，9(9):17－18

［6］黃占旺，上官新晨，程軍輝．納豆混合發(fā)酵技術研究［J］．中國食品學報，2005，5(4):70－73

［7］趙貴興，陳霞，劉昊飛，等．花生的功能成分、營養(yǎng)價值及其開發(fā)利用研究［J］．安徽農(nóng)學通報，2011，17(12)

［8］陳麗花，陳有容，齊鳳蘭．功能性食品—納豆的研制［J］．上海水產(chǎn)大學學報，2001，10(2):187－189

［9］單吉祥，陳杰，陳利忠，等．響應面法優(yōu)化牛肉干發(fā)酵工藝的研究［J］．食品工業(yè)科技，2010(04):286－292

［10］齊鳳蘭，奚銳華，陳有容．納豆生產(chǎn)工藝的優(yōu)化［J］．食品工業(yè)，2004(3):50－52

［11］王冬燕，王遠紅，郭麗萍，等．納豆中氨基酸態(tài)氮含量的測定［J］．食品工業(yè)科技，2010(9):361－362

［12］穆華榮，于淑萍．食品分析［M］．北京:化學工業(yè)出版社，2004．7

［13］臧學麗．發(fā)酵黑豆功能成分及應用研究［D］．吉林:吉林農(nóng)業(yè)大學，2006．6

［14］衛(wèi)生部．GB/T 5009．124—2003食品中氨基酸的測定［S］．北京:中國標準出版社，2003

［15］曹小紅，蔡萍，李凡，等．利用響應面法優(yōu)化Bacillus natto TK－1產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基［J］．中國生物工程雜志，2007，27(4):59－65

［16］孫艷輝，董英．響應面法優(yōu)化以豆渣為基質(zhì)發(fā)酵納豆菌［J］．食品科學，2007，28(4):208－211

［17］Douglas C．Montgomery．Design and analysis of experiments［M］．3rd ed．NewYork:John Wiley＆Sons，1991

［18］SB/T 10528—2009納豆［S］．

［19］孫艷輝，董英．響應面法優(yōu)化以豆渣為基質(zhì)發(fā)酵納豆菌［J］．食品科學，2007，28(4):208－211

［20］徐恒啟，陳克利．國內(nèi)抗凝血、抗血栓多糖的藥理研究進展［J］．生物學雜志，2005，22(2):14－16．

Optimization of Fermentation Process of Peanut－Natto by Response Surface Methodology

Qi Fengyuan Li Huanhuan Yang Li Wang Guoyang Ma Yong
(College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Jinzhou Liaoning 121013)

Soybeans and peanuts were used as raw material to make peanut－natto and study its best making process conditions Filtering the most three important factors which affect fermentation of peanut－natto by Plackett－Burman experiment:the mass ratio，inoculum size and the fermentation time of soybean and peanuts;taking sensory evaluation and amino－acid nitrogen as indexes to determine the optimum fermentation conditions through steepest ascent experiment and Box －Behnken experiment．The result shows that the mass ratio of soybeans and peanuts as4∶1，steaming for 30 min at 121℃，inoculum size of 3%，fermenting for 18 h at 40℃ ．Peanut－natto is better than traditional natto in sensory quality and flavors．

peanut－natto，fermentation，sensory evaluation，amino －acid nitrogen

TS214．9

A

1003－0174(2012)10－0087－06

遼寧省教育廳——納豆系列產(chǎn)品的開發(fā)與研制(2009 A035)

2012－01－06

齊鳳元，女，1960年出生，教授，碩士生導師，食品資源開發(fā)與利用