不同外源物對(duì)亞麻籽油室溫氧化自由基變化的影響

段虎平，寇宇星,2，周 笙，溫毓秀，高 媛，于修燭,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

亞麻籽油是一種兼具營養(yǎng)性和功能性的食用油，不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)85%以上，其中α-亞麻酸在不飽和脂肪酸中的相對(duì)含量為40%～60%，其易發(fā)生氧化酸敗[1-3]。油脂室溫氧化過程中主要以不飽和脂肪酸的自動(dòng)氧化為主，而自動(dòng)氧化是典型的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[4-6]。在不飽和脂肪酸的自動(dòng)氧化反應(yīng)過程中，首先生成烷基自由基（R·），R·再與氧氣反應(yīng)產(chǎn)生烷過氧自由基（ROO·），ROO·會(huì)奪取其他不飽和脂肪酸分子中的氫，形成氫過氧化物（ROOH），ROOH易分解形成次級(jí)氧化產(chǎn)物（酮、醛、醇和酸等），最終導(dǎo)致油脂氧化酸敗[6-8]。Yadav等[9]探究亞麻籽油氧化潛在機(jī)制，結(jié)果表明α-亞麻酸和亞油酸結(jié)構(gòu)中含有的隔離雙鍵（兩個(gè)雙鍵之間隔著一個(gè)亞甲基，即－CH＝CH－CH2－CH＝CH－）容易被兩邊的雙鍵活化而非?；钴S，引發(fā)自動(dòng)氧化或光氧化。通過不同外源物可抑制或促進(jìn)油脂氧化過程中自由基的生成。叔丁基對(duì)苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）、VE等抗氧化劑[10-11]，可提供氫原子（H·）與ROO·或烷氧自由基（RO·）反應(yīng)，抑制鏈引發(fā)和鏈增長[12-14]，延緩油脂氧化；偶氮二異庚腈（2,2’-azobisisoheptonitrile，ADVN）和葉綠素（chlorophyll，Chl）等促氧化劑可與氧反應(yīng)生成自由基[15-18]，加速油脂氧化。因此，在加工和貯藏過程中去除促氧化物質(zhì)也是延緩油脂氧化的手段之一。

電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）是一種研究順磁性物質(zhì)中未成對(duì)電子特性的波譜方法[19]。目前，EPR方法已廣泛應(yīng)用于自由基的檢測[20-22]，油脂氧化過程中產(chǎn)生的自由基性質(zhì)活潑且不穩(wěn)定[23-27]。崔娜娜等[28]檢測60 ℃烘箱法加速榛子油氧化過程中的自由基產(chǎn)生規(guī)律，結(jié)果表明：榛子油氧化0～25 d，自由基相對(duì)含量從8.41緩慢增加至12.96，氧化25 d后自由基相對(duì)含量急劇增加，氧化至40 d時(shí)自由基相對(duì)含量高達(dá)28.09。Xie Yunfei等[29]探究花生油氧化過程中自由基的變化，在90 ℃加速氧化過程中主要產(chǎn)生5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物未知自由基（5,5-dimethyl-1-pyrrolineN-oxide-X radicals，DMPO-X）和RO·，120 ℃氧化時(shí)主要產(chǎn)生R·。李培等[30]探究花生油加速氧化過程中自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，結(jié)果表明：加速氧化過程中產(chǎn)生大量的R·及少量RO·和ROO·。Raitio等[31]探究半固態(tài)棕櫚油在50 ℃條件下貯存7 d的氧化情況，結(jié)果表明油脂貯存過程中次級(jí)過氧化物的形成量與自由基的產(chǎn)生量呈正相關(guān)。Skoutas等[32]使用DMPO檢測和區(qū)分初榨橄欖油中的自由基，發(fā)現(xiàn)80%～90%為RO·和ROO·。綜上，多數(shù)研究主要集中在利用EPR方法探究不同油脂加速氧化過程中自由基的變化，對(duì)油脂室溫氧化過程中自由基變化研究報(bào)道較少。

核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）能夠提供化合物分子中所有氫原子結(jié)構(gòu)的信息，據(jù)此可計(jì)算對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)在樣品中的含量并探討油脂氧化過程[33-34]。本實(shí)驗(yàn)以不同抗氧化劑、促氧化劑和亞麻籽油為研究對(duì)象，利用EPR方法探究添加外源物對(duì)亞麻籽油室溫氧化過程中自由基的影響，結(jié)合亞麻籽油1H NMR分析其氧化變化，以期為亞麻籽油氧化自由基產(chǎn)生規(guī)律的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMPO、VE、TBHQ、ADVN 阿拉丁試劑（上海）有限公司；亞麻籽油（壓榨一級(jí)，標(biāo)簽注明未添加任何抗氧化劑，脂肪酸組成相對(duì)含量為：亞麻酸（50.61±0.23）%、油酸（18.61±0.31）%、亞油酸（16.07±0.01）%、棕櫚酸（5.76±0.12）%、硬脂酸（4.22±0.13）%） 錫林郭勒盟紅井源油脂有限公司；甲苯、冰乙酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉等（均為分析純） 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

DMPO溶液的配制：將DMPO溶于甲苯，配制成濃度為2.0 mol/L，置于棕色試劑瓶中，于－20 ℃冰箱中避光密封保存待用。

Chl提取液的制備：取5 g新鮮菠菜，去莖取葉，洗凈剪碎，放入研缽中充分研磨，加入20 mL無水乙醇在50 ℃下超聲30 min，超聲功率為100 W。超聲后離心（4 000 r/min、15 min）取上清液，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾，得到Chl提取液。

1.2 儀器與設(shè)備

EMX plus-10/12電子自旋共振波譜儀 德國布魯克Bruker公司；Bruker Avance III型核磁共振波譜儀 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 亞麻籽油室溫氧化

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，亞麻籽油在室溫暴露于環(huán)境中氧化10 d后過氧化值（peroxide value，POV）已超過30 meq/kg，不符合國家標(biāo)準(zhǔn)（POV≤12 meq/kg）。分別取3 mL的亞麻籽油置于50 mL燒杯中，將其置于自然光室溫和避光室溫兩種條件下貯藏氧化10 d。自然光室溫條件下的亞麻籽油分為未添加外源物的對(duì)照組和添加外源物的實(shí)驗(yàn)組。外源物配制過程：分別精確稱取0.02 g外源物（TBHQ、VE、ADVN和Chl提取液）溶于100 g的亞麻籽油中，超聲3～4 min使外源物溶解，得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%外源物的亞麻籽油待測樣品。

1.3.2 EPR分析

對(duì)室溫貯藏樣品每隔1 d各取200 μL加入核磁管中，再加入20 μL DMPO溶液混勻，5 min后將核磁管置于達(dá)到設(shè)定溫度的EPR儀器諧振腔內(nèi)進(jìn)行測試。

EPR主要技術(shù)參數(shù)：磁場強(qiáng)度：磁極距72 mm時(shí)最大的磁場強(qiáng)度為1.45 T；掃場分辨率：128 000；微波頻率：X-波段，9.2～9.8 GHz；靈敏度≤1.5×109spins/G線寬；液氮變溫：100～700 K；液氦變溫：1.8～300 K。測定條件：中心磁場為3 345.45 G；掃場寬度為100.00 G；掃場時(shí)間為20.0 s；微波功率為3.99 mW；調(diào)制幅度為1.000 G；轉(zhuǎn)換時(shí)間為10.00 ms；加熱溫度：373.15 K。

1.3.31H NMR分析

取5 mL的亞麻籽油置于50 mL燒杯中，在室溫（20±2）℃自然光下氧化10 d，取氧化前和氧化后的樣品各50 μL于玻璃離心管中，加入含有0.03%四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS）的氘代氯仿（CDCl3）約0.5 mL，混合均勻，裝入直徑為5 mm的核磁管中待測。

1H NMR測定條件參考李添寶等[35]的方法并稍作修改，具體參數(shù)：500 MHz；BBO探頭；1H NMR的觀察頻率為500.13 MHz；1H分辨率為0.45 Hz。每次測定均進(jìn)行勻場、調(diào)諧；脈沖序列：zg30；譜寬：10 330.6 Hz；掃描16 次；空掃2 次；每個(gè)樣品測量3 次；譜圖處理時(shí)以四甲基硅烷定位。

1.3.4 過氧化值測定

POV參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測定》中的滴定法測定。

1.3.5 相關(guān)譜圖分析

EPR譜圖：自由基的自旋朗德因子（g因子也稱g值）為自由基譜圖中心點(diǎn)，首先，通過EPR儀器自帶的Xenon軟件點(diǎn)擊譜圖中心點(diǎn)可直接讀出g值，實(shí)驗(yàn)中擬合到的自由基g值均為2.006。其次，對(duì)樣品的自由基譜圖進(jìn)行基線校正，接著進(jìn)行二次積分，再使用自旋定量功能，可得到該樣品的自旋總數(shù)和自旋濃度。通過Xenon軟件中的自旋擬合功能對(duì)樣品的實(shí)驗(yàn)譜圖進(jìn)行計(jì)算機(jī)擬合，得到各自由基加合物的超精細(xì)耦合常數(shù)，進(jìn)而確定自由基的種類，根據(jù)擬合譜圖中不同自由基的峰面積對(duì)其定量。1H NMR譜圖使用Topspin3.5軟件進(jìn)行處理，譜圖經(jīng)校正零點(diǎn)后標(biāo)峰，并讀出峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次平行，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻籽油室溫氧化過程中自由基變化分析

2.1.1 亞麻籽油室溫氧化過程中自由基種類變化

亞麻籽油室溫氧化過程中的EPR實(shí)驗(yàn)譜圖、擬合譜圖及各自由基自旋數(shù)的變化分別見圖1A、B，亞麻籽油的EPR譜圖經(jīng)擬合得到4 種自由基加合物：烷基自由基加合物（alkyl radical adducts，ARA）、烷氧自由基加合物（alkoxyl radical adducts，AORA）、烷過氧自由基加合物（alkyl peroxyl radical adducts，APRA）以及DMPO-X，其通常被認(rèn)為是DMPO氧化后產(chǎn)生的自由基。

圖1 亞麻籽油的EPR實(shí)驗(yàn)譜圖、擬合譜圖（A）及其各自由基自旋數(shù)的變化（B）Fig. 1 Experimental and simulated EPR spectra (A) and change in the number of spins in free radicals of linseed oil (B)

由圖1A可知，亞麻籽油的EPR實(shí)驗(yàn)譜圖與擬合譜圖基本一致，擬合效果良好。從擬合結(jié)果可以看出，亞麻籽油中存在4 種自由基，它們分別是DMPO-X、R·、RO·和ROO·，其各自的超精細(xì)耦合常數(shù)如表1所示。由圖1B可知，亞麻籽油中含量最高的自由基是DMPO-X，RO·次之，R·和ROO·含量最低，在氧化至第6天時(shí)，4 種自由基含量呈明顯上升趨勢，這可能是處于自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的分裂階段，氫過氧化物分解產(chǎn)生較多的自由基，第7天后逐漸下降。

表1 亞麻籽油中DMPO捕獲的自由基EPR參數(shù)Table1 EPR parameters of trapped radicals by DMPO in linseed oil

2.1.2 亞麻籽油室溫氧化前后的1H NMR變化

亞麻籽油氧化前和室溫氧化10 d后的1H NMR譜圖分別見圖2A和圖2B。亞麻籽油中最主要的脂肪酸是亞麻酸，δ0.96歸屬為亞麻酸末端－CH3上的H，δ1.29歸屬為－CH2上的H（脂肪族亞甲基氫），δ1.60歸屬為與－C＝O相隔1 個(gè)－CH2的亞甲基上的H，δ2.02歸屬為與－C＝C雙鍵相鄰的亞甲基上的H（烯丙基氫），δ2.25歸屬為和－C＝O直接相連的亞甲基上的H，δ2.78歸屬為位于兩個(gè)－C＝C－雙鍵之間的亞甲基上的H（雙烯丙基氫），δ4.15和δ4.3歸屬于甘油三酯中甘油醇上亞甲基的2 個(gè)H，δ5.28為甘油醇次甲基上的H，δ5.32歸屬為所有脂肪酸中雙鍵上的H，δ7.26屬于溶劑CDCl3[35]。由圖2A和圖2B可知，氧化前后亞麻籽油中各圖譜沒有發(fā)生明顯變化，僅數(shù)量略有變化。對(duì)比氧化前后譜圖上各峰的面積積分可知，氧化后的亞麻籽油中雙烯丙基氫質(zhì)子和烯丙基氫質(zhì)子的數(shù)量降低，表明RH氧化前期被引發(fā)生成R·和H·；而雙鍵上的氫及亞麻酸末端甲基上的氫質(zhì)子數(shù)量均降低，表明H·與活躍的ROO·結(jié)合生成ROOH后，隨著ROOH的積累，其中一部分ROOH 發(fā)生分解和聚合反應(yīng)生成醛、酮、醇和酸等小分子，這與亞麻籽油的EPR譜圖相吻合，ROO·隨著氧化的進(jìn)行發(fā)生分解，導(dǎo)致其含量相對(duì)較低。

圖2 亞麻籽油氧化前（A）和室溫氧化10 d后（B）的1H NMR譜圖Fig. 2 1H NMR spectra of linseed oil before (A) and after 10 d oxidation at room temperature (B)

2.2 不同外源物對(duì)亞麻籽油室溫氧化過程中自由基變化的影響

2.2.1 不同外源物對(duì)亞麻籽油室溫氧化過程中POV變化的影響

由圖3可知，添加不同外源物對(duì)亞麻籽油的氧化有不同程度的影響，避光及添加TBHQ可有效減緩亞麻籽油的氧化，添加ADVN對(duì)亞麻籽油的POV影響很小，而Chl則會(huì)促進(jìn)亞麻籽油的氧化。VE對(duì)亞麻籽油的影響具有兩面性，在氧化前期由于其具有強(qiáng)還原性，貯藏第1天添加VE的亞麻籽油樣品中POV低于其他樣品，而在氧化中后期，VE消耗到一定程度后加速其氧化，且氧化速率高于其他處理組。

圖3 添加不同外源物的亞麻籽油室溫氧化過程中POV的變化Fig. 3 Changes in peroxide value of linseed oil added with various exogenous substances during the oxidation process at room temperature

2.2.2 不同外源物對(duì)亞麻籽油室溫氧化過程中各自由基自旋總數(shù)變化的影響

不同外源物對(duì)亞麻籽油室溫氧化過程中各自由基自旋總數(shù)變化的影響見圖4。添加不同外源物的亞麻籽油在室溫氧化過程自旋總數(shù)一直處于波動(dòng)狀態(tài)，避光貯存的亞麻籽油的自旋總數(shù)相對(duì)較高，可能是由于亞麻籽油中最主要的脂肪酸是亞麻酸，在避光條件下引發(fā)的自由基不活潑，短時(shí)間內(nèi)不易轉(zhuǎn)化為氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致DMPO捕獲到的自由基含量偏多[36]，因此檢測得到的自旋總數(shù)相對(duì)較高。而其他條件下亞麻籽油在氧化前期自旋總數(shù)低，氧化后期略有升高，這可能是在光照的影響下，DMPO捕獲的自由基快速轉(zhuǎn)化成油脂氧化的非自由基產(chǎn)物，如次級(jí)產(chǎn)物醛、酮、醇和酸等小分子物質(zhì)，導(dǎo)致整個(gè)氧化過程自旋總數(shù)偏低。加入TBHQ的亞麻籽油整體自旋總數(shù)都處于較低水平，這可能是TBHQ作為抗氧化劑，可有效減少RO·和ROO·的含量，一定程度上阻斷了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而起到抗氧化作用。加入VE的亞麻籽油在氧化前期自旋總數(shù)較低，氧化后期自旋總數(shù)大幅升高，這可能是由于VE消耗后的產(chǎn)物引發(fā)了某種自由基的生成，進(jìn)而促進(jìn)了亞麻籽油氧化。ADVN作為自由基引發(fā)劑，加入后使體系中自旋總數(shù)不斷升高。Chl剛加入亞麻籽油中即引發(fā)大量自由基的生成，使得初始自旋總數(shù)較高，這主要是由于Chl是光敏性物質(zhì)，作為促氧化劑可加速亞麻籽油氧化，產(chǎn)生大量自由基，隨氧化時(shí)間的延長，自由基含量則維持在較低水平。

圖4 添加不同外源物的亞麻籽油各自由基自旋總數(shù)隨貯藏時(shí)間的變化Fig. 4 Changes in the number of spins in free radicals of linseed oil added with various exogenous substances over time

2.2.3 亞麻籽油室溫避光氧化過程中自由基變化分析

亞麻籽油室溫避光氧化的EPR實(shí)驗(yàn)譜圖、擬合譜圖及各自由基自旋數(shù)的變化分別見圖5A、B。由圖5A可知，亞麻籽油在避光氧化時(shí)主要形成4 種自由基，分別是DMPO-X、R·、RO·、ROO·，與自然光照下相一致。由圖1B可以看出，在不同的氧化條件下，這4 種自由基的含量有明顯區(qū)別。自然光下氧化的亞麻籽油中自由基含量排序?yàn)镈MPO-X＞RO·＞R·＞ROO·，由圖5B可知，避光氧化的亞麻籽油中自由基含量排序?yàn)镽O·＞DMPO-X＞R·＞ROO·，這可能是由于避光氧化時(shí)，DMPO捕獲的自由基不活潑，生成的自由基加合物未發(fā)生裂解反應(yīng)，導(dǎo)致避光時(shí)自由基含量比自然光下高。據(jù)此推斷，自然光利于DMPO-X的產(chǎn)生，而避光利于RO·的產(chǎn)生。

圖5 室溫避光氧化的亞麻籽油的EPR實(shí)驗(yàn)譜圖、擬合譜圖（A）及各自由基自旋數(shù)的變化（B）Fig. 5 Experimental and simulated EPR spectra (A) and change in the number of spins in free radical of oxidized linseed oil at room temperature and in darkness (B)

2.2.4 不同外源物對(duì)亞麻籽油室溫氧化過程中自由基變化的影響

亞麻籽油室溫氧化過程中添加VE、Chl、ADVN和TBHQ的EPR實(shí)驗(yàn)譜圖、擬合譜圖及各自由基自旋數(shù)的變化分別見圖6A～G。

圖6 不同外源物的亞麻籽油的EPR實(shí)驗(yàn)譜圖、擬合譜圖及各自由基自旋數(shù)的變化Fig. 6 Experimental and simulated EPR spectra and change in the number of spins in free radicals of linseed oil added with various exogenous substances

由圖6A、B可知，添加VE的亞麻籽油中自由基含量排序?yàn)镈MPO-X＞RO·＞R·＞ROO·，VE作為抗氧化劑加入亞麻籽油減緩了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行，在氧化后期樣品中自旋總數(shù)急劇升高，主要依賴于DMPO-X的含量升高。由圖6C、D可知，添加Chl的亞麻籽油在氧化初期自旋總數(shù)高，可能的原因是，Chl的加入引發(fā)了RO·和ROO·大量生成，隨著氧化時(shí)間的延長，RO·和ROO·回到初始水平，而DMPO-X的含量大幅升高。由圖6E、F可知，添加ADVN的亞麻籽油在氧化初期與添加Chl的亞麻籽油自由基變化趨勢基本一致，自旋總數(shù)高，不同的是，在氧化初期本組樣品中僅產(chǎn)生3 種自由基，分別是DMPO-X、無機(jī)碳中心自由基和R·，在整個(gè)氧化過程中DMPO-X的信號(hào)強(qiáng)度一直保持在較高水平，無機(jī)碳中心自由基次之。氧化中期體系中開始生成ROO·，氧化后期開始生成RO·。當(dāng)樣品處于快速氧化期間時(shí)，RO·一旦產(chǎn)生則很快參與自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而生成其他中間產(chǎn)物，導(dǎo)致其含量低，達(dá)不到儀器檢測限。因此，該組樣品氧化至第8天時(shí)開始出現(xiàn)RO·，ROO·的變化與RO·類似。由圖6G可知，添加TBHQ的亞麻籽油的EPR譜圖信號(hào)過低，不同的自由基之間譜帶重疊多，難以解析，這主要是由于TBHQ作為抗氧化劑阻斷了自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行。

3 結(jié) 論

在亞麻籽油室溫氧化過程中，RO·的產(chǎn)生和分解與氧化程度直接相關(guān)。不同外源物主要影響亞麻籽油室溫氧化過程中各自由基含量變化，而對(duì)自由基的種類變化影響不大。亞麻籽油在室溫自然光，避光，室溫自然光添加TBHQ、VE和Chl氧化過程中產(chǎn)生的自由基種類為DMPO-X、R·、RO·和ROO·，添加ADVN會(huì)引發(fā)無機(jī)碳中心自由基。自然光條件下產(chǎn)生的自由基以DMPO-X為主；避光條件下的自旋總數(shù)整體上高于其他組，以RO·為主；添加TBHQ可有效減少RO·和ROO·的含量，自旋總數(shù)都處于較低水平；添加VE后，在氧化前期自旋總數(shù)較低，后期大幅升高，可延遲DMPO-X最高信號(hào)強(qiáng)度的出現(xiàn)時(shí)間，且對(duì)R·生成也有顯著抑制作用；添加Chl后，在氧化前期大量生成RO·和ROO·，可抑制DMPO-X的生成，后期對(duì)RO·的生成有一定的抑制，而DMPO-X的含量大幅升高；ADVN添加組在氧化初期僅產(chǎn)生3 種自由基，分別是DMPO-X、無機(jī)碳中心自由基和R·，氧化過程中DMPO-X保持較高水平，氧化中期產(chǎn)生ROO·，后期產(chǎn)生RO·。