西藏牦牛源沙門菌的分離鑒定及耐藥分析

李天嬌，周賽賽，斑馬澤郎，吳 丹，盧姊豪，尹力鴻，2，呂家煌，2，趙曉慧，李 霞，索朗斯珠* (.西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000；2.江蘇省農業(yè)科學院 獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 2008)

沙門菌(Salmonella)屬腸桿菌科沙門菌屬，為革蘭陰性短小桿菌。沙門菌血清型較多，國內常見血清型均具有一定致病性，可引發(fā)人畜共患病[1-2]。據國內外文獻報道[3-11]，沙門菌在禽類、家畜、寵物和野生動物中均有發(fā)現，并引發(fā)相關疫?。灰渤Ｔ谑澄锛捌湓牧现写嬖?，引起人類食物中毒[12-14]。同時，沙門菌呈全球性分布，由沙門菌引起的疫情曾在世界多國大規(guī)模暴發(fā)[15]。動物感染沙門菌常引發(fā)腹瀉、腸炎、流產和敗血癥等疾病[16]。沙門菌的流行也嚴重威脅著牛群的健康：成牛感染沙門菌的臨床特征表現為水樣或血性腹瀉，常伴有發(fā)熱、食欲不振、精神沉郁等癥狀；犢牛感染沙門菌的死亡率遠高于成牛[17]。

牦牛是生長于我國高海拔地區(qū)的獨特物種，也是西藏當地牧民的主要經濟來源之一，西藏更是我國牦牛的主產區(qū)之一[18]。沙門菌在牧區(qū)長期處于流行狀態(tài)，主要通過糞口傳播，加之牧區(qū)牦牛的養(yǎng)殖模式主要以放牧為主，因此環(huán)境中的水源和食物極易被污染，從而使其他健康牛也被感染患病，甚至死亡，嚴重影響牦牛及其產業(yè)的健康發(fā)展[19]。目前，國內外關于牦牛源沙門菌的研究報道較少，有關西藏地區(qū)沙門菌的研究更少[20]。因此本研究從西藏部分地區(qū)腹瀉牦牛的糞便中分離沙門菌，并對其進行血清型分型、遺傳進化分析、耐藥表型和耐藥基因分析，為西藏牦牛源沙門菌的防治、后續(xù)相關研究以及臨床用藥提供科學的指導。

1 材料與方法

1.1 樣品本試驗共采集西藏腹瀉牦牛糞便91份，其中拉薩市44份、林芝市21份、那曲市26份，將采集的糞便樣品編號后置于-80℃保存。

1.2 主要試劑BPW培養(yǎng)基、MRSV培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基購自美國BD上海有限公司；SS培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、TSI培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂及12種抗菌藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭染色試劑盒購自青島海博生物技術有限公司；TR101沙門菌屬診斷血清試劑盒購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0)、DL2000 DNA Marker購自大連寶生物有限公司。

1.3 細菌分離純化參照GB4789.4-2010[21]和LIU等[22]的方法對樣品中的細菌進行分離鑒定。利用BPW培養(yǎng)基對糞便樣品進行預增菌，在MRSV半固體培養(yǎng)基上對增菌液進行初篩，初篩后在SS瓊脂和BS瓊脂選擇性培養(yǎng)基上復篩，對篩選出的單菌落進行革蘭染色并鏡檢。

1.4 生化試驗用純培養(yǎng)的菌液轉種TSI斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h后觀察結果，判定標準見表1。

表1 沙門菌生化試驗判定標準

1.5 特異性基因鑒定通過PCR技術檢測分離菌株的特異性基因invA[23-24]，利用引物序列：5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′；5′-TC-ATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′對分離菌株進行PCR鑒定，通過1.0%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳分析。

1.6 血清型檢測沙門菌的血清型鑒定嚴格按照寧波天潤生物藥業(yè)有限公司提供的TR101沙門菌屬血清診斷說明書操作，觀察凝集的情況，記錄結果。

1.7 藥敏試驗參照世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的K-B法進行該試驗[36]。將純培養(yǎng)菌液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂上，將12種藥敏片貼于平皿中央，于37℃倒置培養(yǎng)24 h。參照NCCLS(2013)公布的標準，根據抑菌圈大小，對結果做出判定，藥敏結果判定標準見表2。

表2 藥敏結果判定標準

1.8 耐藥基因檢測參考文獻[26-29]，選擇與6類抗生素相關的15種耐藥基因進行PCR擴增，引物序列見表3。

表3 沙門菌耐藥基因擴增引物及相關信息

1.9 構建系統(tǒng)發(fā)育樹對分離菌株的invA基因進行PCR檢測后，回收特異性擴增片段，將之克隆至pMD18-T載體并進行測序。用NCBI網站在線BLAST程序對測序結果進行比對；利用MEAG 7.0軟件，選取部分在GenBank已登錄的序列進行比對并構建遺傳進化樹。

2 結果

2.1 細菌培養(yǎng)分離菌株在BS培養(yǎng)基上形成表面光滑、有金屬光澤的黑色單菌落，同時也會形成另一種灰綠色菌落；在SS培養(yǎng)基上形成中心有黑點的無色單菌落；革蘭染色的鏡檢結果顯示其為革蘭陰性短小桿菌(圖1)。

圖1 西藏牦牛源分離菌株革蘭染色鏡檢結果(1 000×)

2.2 生化鑒定11株分離菌株均能與三糖鐵反應產生H2S，并生成黑色沉淀，能產氣、產酸且具有動力，結果見圖2。

圖2 西藏牦牛源分離菌株生化試驗結果

2.3 特異性基因鑒定對分離菌株invA基因進行PCR擴增，產物條帶大小約280 bp，與目的條帶大小一致，確定分離獲得11株沙門菌，鑒定結果見圖3，總檢出率為12.08%(11/91)，其中拉薩市3株、那曲市5株、林芝市3株，沙門菌地理位置占比見圖4。

M.DL2000 DNA Marker；+.陽性對照；-.陰性對照；L1～L2.拉薩市樣品；Z1～Z2.林芝市樣品；N1～N2.那曲市樣品圖3 牦牛源沙門菌invA基因PCR擴增結果

圖4 11株牦牛源沙門菌地理位置分布及占比

2.4 血清型鑒定血清型分型鑒定結果顯示：都柏林沙門菌3株，占比27.18%(3/11)；丙型副傷寒沙門菌3株，占比27.28%(3/11)；傷寒沙門菌2株，占比18.19%(2/11)；紐波特沙門菌、阿邦尼沙門菌以及腸炎沙門菌各1株，占比9.10%(1/11)。

2.5 藥物敏感性試驗由表4可知，分離菌株對6類藥物均表現出不同程度的耐藥，其中對β-內酰胺類藥物的耐藥率最高， 對AM、CAZ和CTX的耐藥率均為81.82%(9/11)，對CFZ的耐藥率為72.73%(8/11)；對喹諾酮類藥物敏感性較高，對NA、CIP的耐藥率均為18.18%(2/11)。林芝市分離的菌株耐藥情況與其他地區(qū)相比較為嚴重(圖5)，分離菌株普遍存在多重耐藥現象，普遍對3種(L1、N1)及3種以上抗生素耐藥，個別菌株(Z2)對10種抗生素耐藥。

表4 11株西藏牦牛源沙門菌對12種抗生素藥物敏感性試驗結果

注：S.敏感；I.中介；R.耐藥圖5 11株西藏牦牛源沙門菌分離株藥物敏感性檢測結果

2.6 耐藥基因檢測6類藥物相關耐藥基因的PCR檢測結果如表5顯示：3個地區(qū)分離的菌株均對喹諾酮類藥物不耐藥；拉薩市的3株分離菌和那曲市的5株分離菌均對其余5類藥物耐藥；林芝市的3株分離菌對其余4類藥物耐藥，對磺胺類藥物不耐藥。此外，四環(huán)素類耐藥基因tetA的檢出率高達90.91%；其次是β-內酰胺類耐藥基因blaTEM和氯霉素類耐藥基因floR，檢出率為81.82%；而喹諾酮類耐藥基因gyrA和gyrB均未檢出。

表5 11株西藏牦牛源沙門菌耐藥基因PCR檢測結果

2.7 構建系統(tǒng)發(fā)育樹對6株(每個地區(qū)2株不同血清型沙門菌)牦牛源沙門菌分離株的invA基因序列與GenBank登錄的核苷酸序列進行同源性比對分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果如圖7顯示，西藏牦牛源沙門菌與人源(CP054827.1、CP050728.1)、禽源(CP043563.1、CP051286)、豬源(CP053294.1)、羊源(CP034716.1)、牛源(CP025241.1)以及食物源(CP060507.1)沙門菌同源性為99%～100%；拉薩市分離株L2與那曲分離株N2在同一分支；林芝市分離株與其他分離株同屬另一分支；拉薩市分離株L1與食物源沙門菌(CP033255.2、CP033352.2)在同一分支；那曲市分離株N1和林芝市分離株Z2在同一分支，林芝市分離株Z1單獨屬于一個分支。

注：L1，L2.拉薩市分離菌；Z1，Z2.林芝市分離菌；N1，N2.那曲市分離菌；標尺表示遺傳距離，指每個位點有0.000 5個氨基酸替換圖7 西藏牦牛源沙門菌invA基因序列進化樹

3 討論

本試驗對采集自西藏拉薩、那曲和林芝3個地區(qū)的腹瀉牦牛糞便進行了細菌的分離培養(yǎng)，并對分離菌進行了染色鏡檢和生化試驗鑒定，結合特異性基因檢測結果確定獲得了沙門菌11株，分離率為12.08%(11/91)。同儲倩等[30]從四川甘孜、阿壩兩地牦牛糞便中分離沙門菌的分離率(8.17%)和柏雪等[31]從青藏高原部分地區(qū)牦牛糞便中分離沙門菌的分離率(9.23%)相比較高。其中，那曲市牦牛源沙門菌的分離率為19.23%(5/26)，占總分離菌數的百分比為45.46%(5/11)，遠高于其他兩地。那曲市與其他兩地相比，海拔更高，牦牛生長環(huán)境更惡劣；同時西藏牦牛養(yǎng)殖主要以放牧為主，導致病牛不能被及時發(fā)現，以至于攜帶病原的糞便易污染水源和食物，造成健康牛只感染。因此，建議定期檢查牛群腹瀉情況，適當更換放牧地點；定期清理牛舍，保持牛舍清潔干燥，定期消毒；同時一旦發(fā)現腹瀉及時醫(yī)治；做好疫病防控的同時，加強養(yǎng)殖環(huán)境的管理。

本試驗分離到的西藏牦牛源沙門菌經血清型鑒定，分為都柏林沙門菌、丙型副傷寒沙門菌、傷寒沙門菌、紐波特沙門菌、阿邦尼沙門菌以及腸炎沙門菌6種。其中都柏林沙門菌、丙型副傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型，該結果與關龍伏等[32]、詹發(fā)茂等[33]和張斌等[34]對不同地區(qū)牦牛源沙門菌優(yōu)勢血清型的研究結果相似。牛作為都柏林沙門菌的天然宿主易被感染，易導致母牛流產，嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)的健康發(fā)展，該結果的發(fā)現應當引起重視[35]。丙型副傷寒沙門菌、傷寒沙門菌和腸炎沙門菌是引起人類腹瀉的主要血清型，同時孔雪英等[36]曾從牦牛肉中分離得到丙型副傷寒沙門菌，因此，相關血清型的公共衛(wèi)生學意義值得引起關注。此外，本次試驗中首次從牦牛源中分離出阿邦尼沙門菌。據文獻報道，阿邦尼沙門菌毒性較強，可引起類似于傷寒沙門菌病的相關癥狀[32,37-38]，提醒我們需加強監(jiān)管。

invA基因作為沙門菌的特異性鑒定基因，編碼沙門菌的入侵蛋白，該蛋白在沙門菌的致病性上起重要作用，invA基因在沙門菌不同種屬間具有高度同源性，與其他生物種屬的核苷酸序列無同源關系[23-24]。本試驗對6株牦牛源沙門菌(6種血清型各一株)與GenBank中已登錄的沙門菌進行對比，結果顯示：西藏牦牛源沙門菌與多種動物源(CP054827.1、CP050728.1、CP043563.1、CP053294.1、CP025241.1等)在同一分支上，說明其親緣性較近，提示我們不同血清型的沙門菌可感染不同的宿主，應加強食品衛(wèi)生管理，避免沙門菌通過食物感染人，從而引起食物中毒等疾病。

對分離到的11株牦牛源沙門菌進行藥物敏感性試驗，結果顯示：分離菌株普遍具有較高的耐藥性。其中，對β-內酰胺類藥物(氨芐西林、頭孢唑林、頭孢噻肟)的耐藥率最高，為81.82%，該結果比劉玉英等[39]報道的36.17%高出許多，同時其相關耐藥基因blaTEM檢出率為81.82%；而對喹諾酮類藥物(萘啶酸和環(huán)丙沙星)的耐藥率為18.18%，相關耐藥基因gyrA和gyrB則未檢出。此外，對四環(huán)素的耐藥率為54.55%，該結果與柏雪等[31]發(fā)現的四環(huán)素藥物耐藥率為60%的結果相近，相關耐藥基因tetB檢出率為45.46%，與柏雪等[31]的研究結果相一致；耐藥基因tetA檢出率為90.91%，耐藥表型與耐藥基因檢出率略有差異，該結果與王華然等[40]發(fā)現的沙門菌四環(huán)素耐藥基因檢出率(80.99%)較為接近。本次試驗中耐藥率和耐藥基因檢測結果基本一致，說明西藏牦牛源耐藥表型與基因型逐漸趨于相同，且存在相關性；但部分結果的差異提示，具體耐藥機制還需深入研究。同時，本次實驗分離的耐藥菌株均表現出不用程度的多重耐藥，主要集中在3～9耐，其中以4耐為主，然后是2耐和6耐，分別占總菌株數的36.36%和18.18%。此次試驗結果說明西藏部分地區(qū)牦牛源沙門菌的耐藥情況較為普遍，單一菌對多種藥物的耐藥情況越來越嚴重，存在同時攜帶多種耐藥基因的情況，提醒我們急需改善臨床用藥的種類和抗生素使用方法。

綜上，本研究發(fā)現沙門菌目前在西藏牦牛中存在一定的流行趨勢，且不同動物源沙門菌存在同源性，而單一菌株的對藥物的耐藥情況和耐藥基因攜帶情況也越來越嚴重，提示相關部門需重視沙門菌的防治，加強監(jiān)管；相關養(yǎng)殖戶需重視養(yǎng)殖環(huán)境，做好衛(wèi)生清潔；同時也應當注重臨床用藥，考慮采取多種藥物交叉使用，避免超級耐藥菌的出現。