糖皮質(zhì)激素受體與胰島素樣生長因子1受體信號(hào)通路參與皮質(zhì)酮所致大鼠心肌細(xì)胞肥大*

郭自景,賀雨晴,唐偉軍

1.湘南學(xué)院藥學(xué)院,湖南 郴州 423000；2.心腦血管天然藥物研究湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 郴州 423000

心臟肥大性生長是為適應(yīng)血液動(dòng)力學(xué)應(yīng)激而產(chǎn)生的代償行為［1］。然而，肥厚型心肌細(xì)胞耗氧量增加，易導(dǎo)致心肌細(xì)胞供需不匹配，誘發(fā)多種心血管疾病，被認(rèn)為是心血管疾病發(fā)病率和死亡率的預(yù)測因子［2］。研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）過表達(dá)小鼠心臟會(huì)發(fā)生生理性肥大，并持續(xù)到成年期［3］，抑制IGF-1R的表達(dá)可以緩解去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大過程，免疫蛋白酶體LMP10亞基敲低小鼠可通過降低IGF1R減少血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大［4］。糖皮質(zhì)激素是一種廣泛應(yīng)用于臨床的激素類藥物，根據(jù)使用目的不同可分為小劑量替代療法、一般劑量維持療法和大劑量沖擊療法三類，糖皮質(zhì)激素主要通過與糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）結(jié)合后發(fā)揮作用，但隨著劑量增加，也可與鹽皮質(zhì)激素受體（mineralocorticoid receptor，MR）結(jié)合發(fā)揮作用。地塞米松（糖皮質(zhì)激素）可促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞肥大［5］，引起病理性心臟重塑和舒張功能障礙，且心肌肥大心臟的糖皮質(zhì)激素水平是升高的［6］。本研究擬探討皮質(zhì)酮（糖皮質(zhì)激素）所致H9c2肥大的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 藥品與試劑

H9c2，購自ATCC細(xì)胞庫；皮質(zhì)酮（CAS：50-22-6）和米非司酮（GR拮抗劑，M8046），購自默克化工；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量試劑盒購自Thermo Scientific，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；引物購自上海生工； 0.25%胰酶，HyClone；胎牛血清（FBS），Gibco；磷酸鹽緩沖液（PBS），HyClone；25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，SORFA；24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，SORFA；DMEM高糖液體培養(yǎng)基，HyClone；Penicillin-Streptomycin Solution（100×），HyClone，引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所需引物信息

1.2 方法

H9c2細(xì)胞分為四組：正常對(duì)照組、皮質(zhì)酮1組、皮質(zhì)酮2組和皮質(zhì)酮3組，在培養(yǎng)基中分別加入終濃度為0、100 nM、1μM和10μM的皮質(zhì)酮培養(yǎng)3天，Trizol裂解細(xì)胞后提取總RNA備用；H9c2細(xì)胞分為四組：米非司酮組、共處理1組、共處理2組和共處理3組，在培養(yǎng)基中加入終濃度為10μM的米非司酮和終濃度分別為0、100 nM、1μM和10μM的皮質(zhì)酮培養(yǎng)3天，Trizol裂解細(xì)胞后提取總RNA備用。

1.3 檢測指標(biāo)和方法

檢測RNA純度及濃度后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再根據(jù)qPCR說明書，定量檢測相關(guān)基因表達(dá)，檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

GR，糖皮質(zhì)激素受體；MR，鹽皮質(zhì)激素受體；IG-F1R，胰島素生長因子1受體。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

qPCR檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。采用SPSS 20.0和Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖標(biāo)制作。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行皮質(zhì)酮與對(duì)照組間的比較，兩組間比較采用雙尾t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 皮質(zhì)酮對(duì)H9c2細(xì)胞GR、MR和IGF-1RmRNA表達(dá)的影響

如圖1所示，正常對(duì)照組、小劑量皮質(zhì)酮組、中劑量皮質(zhì)酮組和大劑量皮質(zhì)酮組GR mRNA表達(dá)量分別為1.191±0.199、2.568±1.252、7.996±2.020和8.682±2.237；MR mRNA表達(dá)量分別為0.151±0.040、0.244±0.083、0.281±0.080和0.506±0.239；IGF-1R mRNA表達(dá)量分別為2.431±0.268、4.489±1.628、8.096±3.422和10.202±1.413與正常對(duì)照組相比，小、中、大劑量皮質(zhì)酮組GR mRNA表達(dá)量升高了1.16、5.72和6.30倍，P值依次為0.024、9.351E-06和9.782E-06；MR mRNA表達(dá)量升高了0.618、0.863和2.356倍，P值依次為0.033、0.005和0.005；IGF-1R mRNA表達(dá)量顯著升高0.85、2.33和3.20倍，P值依次為0.012、0.002和1.157E-07。

圖1 皮質(zhì)酮對(duì)H9c2心肌細(xì)胞GR、MR和IGF-1R mRNA表達(dá)的影響

2.2 米非司酮和皮質(zhì)酮共處理對(duì)H9c2細(xì)胞GR、MR和IGF-1RmRNA表達(dá)的影響

如圖2所示，米非司酮組、共處理組1、共處理2組和共處理3組GR mRNA表達(dá)量分別為2.587±0.589、3.813±2.457、6.106±2.552和8.978±2.261；MR mRNA表達(dá)量分別為0.250±0.048、0.301±0.113、0.404±0.109和0.520±0.072；IGF-1R mRNA表達(dá)量分別為4.148±0.720、4.573±1.234、4.845±1.071和7.107±0.925。與米非司酮組相比，共處理1組對(duì)GR、MR和IGF-1R的調(diào)控?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，共處理2組GR和MR mRNA的表達(dá)分別升高了1.360和0.615倍，P值依次為0.008和0.010；共處理3組GR和MR mRNA的表達(dá)分別升高了2.470和1.076倍，P值依次為5.367E-05和1.730E-05。

圖2 米非司酮和皮質(zhì)酮共處理對(duì)H9c2細(xì)胞GR、MR和IGF-1RmRNA表達(dá)的影響

3 討論

心肌肥大是提高心肌儲(chǔ)備能力和心輸出量的一種適應(yīng)性代償反應(yīng)，根據(jù)發(fā)病機(jī)制可以分為病理性心肌肥大和生理性心肌肥大，通常表現(xiàn)為心肌細(xì)胞體積增大［7］。盡管心肌生長是維持心臟收縮功能的適應(yīng)性反應(yīng)，但心肌肥大是許多心血管疾病發(fā)生的先決條件，發(fā)生在心力衰竭之前。庫欣綜合征是由于長時(shí)間糖皮質(zhì)激素慢性過暴露所導(dǎo)致，早期研究發(fā)現(xiàn)其中位生存期為4.6年，5年生存率僅為50%，其發(fā)病率和死亡率與糖尿病、心臟疾病、高血壓等相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)酮（糖皮質(zhì)激素）可造成小鼠左心室肥大和心臟功能障礙。IGF1是產(chǎn)后發(fā)育過程中身體和器官大小的重要調(diào)節(jié)劑，其可促進(jìn)心臟的生理肥大［8］。IGF1/PI3K途徑活化對(duì)代償性偏心肥大有幫助［9］，可以改善左心室收縮功能［10］。IGF-1R過表達(dá)小鼠心臟會(huì)發(fā)生生理性肥大，并持續(xù)到成年期［3］。Xu的研究也發(fā)現(xiàn)抑制IGF-1R的表達(dá)可以緩解去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大過程［4］。本文研究發(fā)現(xiàn)，小、中、大劑量皮質(zhì)酮組GR mRNA表達(dá)分別升高了1.16、5.72和6.30倍；MRmRNA表達(dá)量升高了0.618、0.863和2.356倍；IGF-1RmRNA表達(dá)量顯著升高0.85、2.33和3.20倍，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜上所述，作者猜測IGF-1RmRNA表達(dá)的升高可能是其所致心肌肥大的一個(gè)原因。皮質(zhì)酮在小劑量時(shí)可通過活化GR發(fā)揮作用，隨著劑量的增加也可通過活化MR調(diào)控基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，心肌和血管平滑肌GR敲除成年小鼠的存活率降低，多普勒測量流經(jīng)二尖瓣的血流顯示，GR敲除小鼠等體積收縮時(shí)間延長，提示其左心室收縮期受損［11］。本文研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮作為GR的競爭性拮抗劑，可以完全阻斷100 nM皮質(zhì)酮對(duì)GR、MR和IGF-1R mRNA表達(dá)的影響，米非司酮部分阻斷1μM和10μM皮質(zhì)酮對(duì)GR（mRNA表達(dá)升高倍數(shù)分別由5.72降到1.36，6.30降到2.47）和MR（mRNA表達(dá)升高倍數(shù)分別由0.863降到0.615，2.356降到1.076）mRNA表達(dá)的影響。

綜上所述，“GR-IGF-1R”而非“MR-IGF-1R”介導(dǎo)了皮質(zhì)酮對(duì)H9c2肥大的調(diào)控。