劉勝桃 宋鴿 王秀艷 李慧娟 常建軍 王宏
摘 要:目的:研究一種可行、適用、準(zhǔn)確的霉菌檢測(cè)培養(yǎng)方法,來(lái)解決培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)基干裂、環(huán)境污染、菌落計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確的問(wèn)題。方法:對(duì)膜包裹法、培養(yǎng)盒法、直接培養(yǎng)法3種方法進(jìn)行比較,來(lái)評(píng)價(jià)3種方法的可行性、適用性和準(zhǔn)確性。結(jié)果:采用直接培養(yǎng)法培養(yǎng)的空白和樣品出現(xiàn)較大程度的污染及干裂現(xiàn)象,膜包裹法、培養(yǎng)盒法培養(yǎng)的樣品未造成污染,培養(yǎng)基未干裂不影響菌落計(jì)數(shù)。結(jié)論:采用隔離的方法能夠有效控制培養(yǎng)基干裂和污染的問(wèn)題,提高菌落計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性,同時(shí)可避免霉菌孢子在培養(yǎng)、觀察過(guò)程中擴(kuò)散到環(huán)境中,造成污染,培養(yǎng)盒法較膜包裹法更方便、快捷、易觀察,是實(shí)驗(yàn)室值得推廣的培養(yǎng)方法。
關(guān)鍵詞:霉菌;污染;干裂;隔離;培養(yǎng)
霉菌是絲狀真菌的統(tǒng)稱(chēng),廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環(huán)境中[1-3],因此食品極易被霉菌污染[4]。霉菌可引起食品、農(nóng)產(chǎn)品的發(fā)霉變質(zhì),霉菌毒素可導(dǎo)致慢性中毒具有致癌、致畸、致突變作用[5],可對(duì)人體健康造成危害[6-12]。霉菌的監(jiān)測(cè)也成為食品檢驗(yàn)技術(shù)與食品衛(wèi)生質(zhì)量評(píng)價(jià)中的重要組成部分[13-16],我國(guó)先后5次修訂了食品中霉菌計(jì)數(shù)的方法標(biāo)準(zhǔn)[17-21],據(jù)此我國(guó)各級(jí)監(jiān)督檢測(cè)機(jī)構(gòu)全面開(kāi)展食品中霉菌的檢測(cè)工作,自《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)》(GB 4789.15—2016)實(shí)施以來(lái)將原標(biāo)準(zhǔn)中倒置平板培養(yǎng)改成正置平板培養(yǎng),霉菌培養(yǎng)中的污染和培養(yǎng)基干裂現(xiàn)象頻發(fā),這主要是因?yàn)槊咕淇僧a(chǎn)生數(shù)量巨大的孢子,同時(shí)霉菌的孢子具有小、輕、干、多、休眠期長(zhǎng)和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn),任何一個(gè)孢子在適宜條件下都能發(fā)展成新的個(gè)體。常規(guī)霉菌檢測(cè)的培養(yǎng)過(guò)程中,以及觀察移動(dòng)過(guò)程中,不可避免地造成空氣流動(dòng),霉菌孢子可趁機(jī)飄散進(jìn)入空氣中并隨處散播、繁殖,引起嚴(yán)重的交叉污染和外部侵染[22]。又因霉菌的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng),培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程中水分損失較大,即使加大了培養(yǎng)基的傾注量,也無(wú)法避免培養(yǎng)基干裂,從而導(dǎo)致影響菌落計(jì)數(shù)的問(wèn)題,而目前這兩項(xiàng)常見(jiàn)且棘手的問(wèn)題始終困擾著相關(guān)人員,且無(wú)有效的控制
措施。
本實(shí)驗(yàn)室在日常霉菌檢測(cè)中采取兩種隔離培養(yǎng)方法,即膜包裹法、培養(yǎng)盒法,對(duì)霉菌孢子擴(kuò)散、污染及培養(yǎng)基干裂的控制效果顯著,且成本低廉,操作簡(jiǎn)便,對(duì)比《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》(GB 4789.15—2016)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)國(guó)標(biāo)法)的計(jì)數(shù)結(jié)果,探討霉菌檢測(cè)過(guò)程中隔離式培養(yǎng)方法的可行性、實(shí)用性和準(zhǔn)確性[23-27]。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
1.1.1 樣品來(lái)源
霉菌和酵母質(zhì)控樣(QC-FD-020),來(lái)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心;霉菌和酵母質(zhì)控樣(A062018M),來(lái)自北京美正檢測(cè)技術(shù)有限公司。
1.1.2 試劑
孟加拉紅瓊脂,CM164,北京陸橋技術(shù)服務(wù)有限公司。
1.1.3 耗材
霉菌培養(yǎng)盒,食品級(jí)PVC材質(zhì),分為4個(gè)凹槽,凹槽與培養(yǎng)皿直徑及高度相匹配,每個(gè)凹槽有3個(gè)透氣孔,培養(yǎng)過(guò)程中形成有氧培養(yǎng)環(huán)境,此裝置為一次性使用,計(jì)數(shù)后的培養(yǎng)皿連同裝置一同高壓滅菌處理即可;保鮮膜或封口膜。
1.2 儀器與設(shè)備
BSC-1300IIB2生物安全柜(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);SSW-600-2S恒溫水箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);MJX-250BⅢ霉菌培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司);MSⅢ basic漩渦混合器(德國(guó)IKA)。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 膜包裹培養(yǎng)法
稱(chēng)取25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中,充分振搖,制成1∶10樣品勻液,取1∶10樣品勻液1 mL,加入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中,旋渦混勻,制成1∶100的樣品勻液,同時(shí)做空白對(duì)照,及時(shí)傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基,待瓊脂凝固后,在潔凈室中將平皿4~6個(gè)疊放,外層包裹保鮮膜或封口膜,在疊放的皿與皿之間用刀劃上長(zhǎng)約2 cm的透氣孔,每層劃2~3個(gè)透氣孔,正置平板,置(28±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),同時(shí)以直接培養(yǎng)法的樣品作為對(duì)照,觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果。
1.3.2 霉菌盒培養(yǎng)法
稱(chēng)取25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中,充分振搖,制成1∶10樣品勻液,取1∶10樣品勻液1 mL,加入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中,旋渦混勻,制成1∶100的樣品勻液,同時(shí)做空白對(duì)照,及時(shí)傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基,待瓊脂凝固后將平皿正置于霉菌盒中,每個(gè)槽可放置一個(gè)培養(yǎng)皿,將上蓋蓋嚴(yán)即可放入(28±1)℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),同時(shí)以直接培養(yǎng)法的樣品做對(duì)照,觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果。
1.3.3 直接培養(yǎng)法
稱(chēng)取25 g樣品加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中,充分振搖,制成1∶10樣品勻液,取1∶10樣品勻液1 mL,加入含有9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中,旋渦混勻,制成1∶100的樣品勻液,同時(shí)做空白對(duì)照,及時(shí)傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基,待瓊脂凝固后,正置平板,置(28±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),同時(shí)以直接培養(yǎng)法的樣品作對(duì)照,觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果。
2 結(jié)果與分析
2.1 膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒培養(yǎng)法與直接培養(yǎng)法結(jié)果比較
對(duì)8組不同類(lèi)型的樣品(已知不含菌樣品)進(jìn)行霉菌檢測(cè),同時(shí)監(jiān)控5組空白實(shí)驗(yàn),每組樣品每個(gè)稀釋度均進(jìn)行兩組平行檢測(cè),用膜包裹培養(yǎng)法和霉菌盒裝置培養(yǎng)的8組實(shí)驗(yàn)樣品及5組空白對(duì)照,均未出現(xiàn)污染、培養(yǎng)基干裂的情況,同時(shí)使用菌片法進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果一致。而采用直接法培養(yǎng)的13組樣品,10組樣品出現(xiàn)不同程度的污染,部分培養(yǎng)基干裂,樣品污染情況占比69%,培養(yǎng)基干裂數(shù)量占
比77%。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,膜包裹培養(yǎng)法和霉菌盒裝置培養(yǎng)法均可將環(huán)境中的污染來(lái)源完全隔離,且可以保證在較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)降低培養(yǎng)基水分的損失。但霉菌盒裝置在結(jié)果觀察過(guò)程無(wú)需打開(kāi)培養(yǎng)盒,可直接透過(guò)培養(yǎng)盒清晰地對(duì)菌落進(jìn)行觀察計(jì)數(shù),達(dá)到從樣品培養(yǎng)到出具結(jié)果,最終到廢棄物處理環(huán)節(jié),培養(yǎng)物與外界環(huán)境始終保證有效的隔離,避免了環(huán)境、樣品、人員相互污染的風(fēng)險(xiǎn)。膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒正置培養(yǎng)法與直接法培養(yǎng)結(jié)果如表1所示。
2.2 膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒培養(yǎng)法準(zhǔn)確性測(cè)試
使用膜包裹培養(yǎng)法及霉菌盒培養(yǎng)法對(duì)6組不同特性區(qū)間及不同廠家的霉菌質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測(cè),每組樣品、每個(gè)稀釋度均進(jìn)行兩組平行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果均在質(zhì)控樣品特性區(qū)間,將膜包裹培養(yǎng)法得到的結(jié)果與霉菌盒培養(yǎng)法得到的結(jié)果配對(duì)T檢驗(yàn),P=0.18>0.05,表明無(wú)顯著性差異;培養(yǎng)過(guò)程中未出現(xiàn)培養(yǎng)基干裂及污染的現(xiàn)象,空白對(duì)照均無(wú)菌落生長(zhǎng),證明了兩種隔離培養(yǎng)方式不會(huì)對(duì)霉菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響,如表2所示。
3 結(jié)論與討論
本研究通過(guò)對(duì)膜包裹法、霉菌盒培養(yǎng)法、直接培養(yǎng)法培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)膜包裹法、霉菌盒培養(yǎng)法可有效解決在培養(yǎng)過(guò)程中水分流失造成的培養(yǎng)基干裂問(wèn)題,且無(wú)污染,同時(shí)對(duì)質(zhì)控樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)上述兩種隔離培養(yǎng)方式不影響菌落計(jì)數(shù),不影響霉菌的生長(zhǎng)。因膜包裹法觀察過(guò)程中需要將膜拆開(kāi),而霉菌盒培養(yǎng)法較膜包裹法的優(yōu)勢(shì)在于在觀察和計(jì)數(shù)過(guò)程中不需要打開(kāi)霉菌盒裝置,透過(guò)裝置可清晰對(duì)菌落進(jìn)行觀察計(jì)數(shù),從平板培養(yǎng)到最終廢棄物處置,培養(yǎng)物與外界環(huán)境始終保證有效的隔離措施,避免了環(huán)境、樣品、人員相互污染的風(fēng)險(xiǎn)。操作方便、成本低廉,霉菌培養(yǎng)盒也可應(yīng)用于培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)和(或)溫度較高的微生物檢測(cè)項(xiàng)目,例如嗜熱需氧芽孢檢測(cè)等,是實(shí)驗(yàn)室值得推廣的培養(yǎng)方法。
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