弓形蟲gra14基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性研究*

陳曉恒 鄭 斌 丁建祖 樓 滌 童群波 孔慶明 陳 睿 陸紹紅

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所， 杭州 310013)

剛地弓形蟲Toxoplasmagondii是一種分布廣泛的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可寄生于包括人在內(nèi)的幾乎所有溫血動物的有核細(xì)胞內(nèi)，引起人畜共患弓形蟲病(Lehmannetal.，2003; Hilletal.，2005)。雖然免疫功能正?；颊叨酂o明顯癥狀，但免疫功能低下或受損者如惡性腫瘤或HⅣ病人，卻可以導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題(Rormanetal.，2006; Innesetal.，2010)。弓形蟲感染人體后可以入侵多種臟器和組織，孕期女性感染弓形蟲可通過母嬰傳播影響胎兒的發(fā)育，造成胎兒畸形，引起流產(chǎn)、早產(chǎn)甚至死胎(Kravetzetal.，2005)。弓形蟲病也給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失，感染后的家畜又會成為感染人的另一條重要途徑(Tenteretal.，2000；Dubeyetal.，2005)。弓形蟲病已經(jīng)日益引起人們的高度重視。但迄今沒有理想的治療藥物，研制弓形蟲疫苗對保護(hù)人體健康和減少畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失具有重要的意義。

由于弓形蟲生活史復(fù)雜，具有多樣化的特異性抗原和高度變異性，以及多種入侵途徑和逃避宿主免疫攻擊的機(jī)制(Zhengetal.，2012)，致使弓形蟲疫苗的研究難度較大。但隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，弓形蟲疫苗的研制也有了較大突破，其中DNA疫苗因其在預(yù)防弓形蟲感染中能夠產(chǎn)生高效、持久的體液免疫和細(xì)胞免疫等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注(Tanetal.，2011；Yanetal.，2012)。

致密顆粒蛋白(Dense granule proteins, GRAs)是弓形蟲入侵宿主細(xì)胞后由致密顆粒釋放入納蟲泡(Parasitophorous vacuble, PV)的一類分泌代謝抗原，具有調(diào)節(jié)和維持納蟲泡和納蟲泡膜結(jié)構(gòu)的作用(Romeetal.，2008)，以保證蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存，部分GRAs還參與蟲體在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長與轉(zhuǎn)錄(Mercieretal.，2005；Romeetal.，2008)。由于此類分泌蛋白一般具有較強(qiáng)的免疫原性，有些已被證實可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性免疫(Jongertetal.，2007；Sunetal.，2011；Quanetal.，2012)，因此GRAs在弓形蟲的診斷及免疫預(yù)防中備受關(guān)注。

弓形蟲GRA14作為致密顆粒蛋白家族中的一員最初由Rome等(2008)發(fā)現(xiàn)，GRA14與GRAs中的GRA3，GRA7共同定位在納蟲泡膜上，在弓形蟲感染宿主細(xì)胞的過程中，GRA14可以在納蟲泡間轉(zhuǎn)移，并且GRA14有較好的保守性，有4個B細(xì)胞抗原表位，表明弓形蟲GRA14可以作為弓形蟲病新型診斷和疫苗制劑的候選抗原(Romeetal.，2008；Chenetal.，2013)。

對GRA14免疫保護(hù)性目前還未見相關(guān)研究，因此本實驗首次以gra14為目的抗原基因，構(gòu)建gra14基因的重組真核質(zhì)粒pVAX1-gra14免疫BALB/c小鼠，研究弓形蟲gra14基因疫苗對抗弓形蟲感染的免疫保護(hù)作用，為研究有效的弓形蟲疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1蟲株與實驗動物：剛地弓形蟲RH強(qiáng)毒株由本實驗室傳代培養(yǎng)。BALB/c小鼠60只(批號：2008001654042，清潔級，雄性，7周齡)由浙江省醫(yī)科院實驗動物中心提供。

1.1.2菌株和質(zhì)粒細(xì)胞：大腸桿菌EscherichiacoliDH5α菌株購于寶賽生物杭州股份有限公司，pVAX1 質(zhì)粒和HEK293細(xì)胞由本實驗室保存和保種。

1.1.3主要實驗試劑：Trizol試劑(Invitrogen)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)，5% BSA(Gibco)，限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ和T4 DNA連接酶(Takara)；質(zhì)粒小提試劑盒(Tiangen)，1× PBS， PVDF膜(millipore)，吐溫-20(Sigma)，刀豆素A(Sigma)，兔抗弓形蟲血清，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG(Sigma)，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(Abcam)；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1蟲體培養(yǎng)：用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)，傳代6 h后接種弓形蟲速殖子，4 d后收集純化弓形蟲用于提取弓形蟲總RNA。

1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)GenBank中弓形蟲gra14基因序列設(shè)計引物，并在上下游引物的5′分別引入HindⅢ、EcoRⅠ酶切位點。上游引物：5′-A A G C T T A T G C A G G C G A T A G C G C G G GG-3′；下游引物：5′-G A A T T C C T A T T C G C T T G G T C T C T G GT-3′(下劃線處是酶切位點)，引物由上海生工公司合成。提取弓形蟲RH蟲株RNA，經(jīng)RT-PCR制備cDNA作為擴(kuò)增模板。gra14基因片段通過HindⅢ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶連接到pVAX1質(zhì)粒上，構(gòu)建pVAX1-TgGRA14重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化入EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。通過酶切、PCR鑒定和DNA測序鑒定，挑選陽性克隆。

1.2.3重組質(zhì)粒的表達(dá)與鑒定:使用質(zhì)粒抽提試劑盒提取pVAX1-gra14質(zhì)粒，NanoDrop2000測量DNA濃度。使用Invitiogen公司的Lipo2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。培養(yǎng)2 d后裂解細(xì)胞，分離純化細(xì)胞總蛋白，并通過Western blot檢測分析。將細(xì)胞裂解純化后的總蛋白通過聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行蛋白印跡分析。采用的一抗是1∶100稀釋的兔抗弓形蟲血清，二抗是1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體。

1.2.4小鼠免疫流程：將60只7周齡的BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組，每組15只。每只實驗組小鼠肌肉注射100 μg pVAX1-gra14質(zhì)粒，對照組分別注射PBS(100 μL/只)和pVAX1空質(zhì)粒(100 μg/只)，空白對照不作處理，也作為對照組。每組小鼠免疫3次，每次間隔14 d。在第0、14和28 d每次免疫前，通過小鼠尾靜脈取血，最后一次加強(qiáng)免疫14 d后取血標(biāo)記為第42 d血樣。所取的血液樣本離心分離血清保存于-20℃?zhèn)溆?，免疫前血清作為陰性對照?/p>

1.2.5免疫后抗體水平檢測: 在96孔板中用可溶性抗原(STAg)包板(1μg/孔)4℃孵育過夜，PBST洗板3次，用含10%BSA的PBS封閉非特異性位點，然后加入稀釋度為1∶100的小鼠血清37℃孵育1 h。PBST洗板3次，加入稀釋度為1∶10 000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、 IgG1和IgG2a抗體。加入TMB顯色液在450 nm測量吸光度值。每份血清樣本做2個復(fù)孔檢測。

1.2.6脾細(xì)胞增殖檢測：末次加強(qiáng)免疫14 d后，每組各取5只小鼠獲取脾臟，制備脾細(xì)胞懸浮液。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中用80% DMEM和20% BSA調(diào)整脾細(xì)胞濃度至5×105細(xì)胞/孔。分別在培養(yǎng)基中加入10 μg/mL的可溶性抗原(STAg)、5 μg/mL的刀豆素(ConA)作為陽性對照和只加培養(yǎng)基的作為陰性對照。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)68 h后，采用MTT法檢測脾細(xì)胞的增殖情況，計算脾細(xì)胞刺激指數(shù)(Stimulation index, SI)。

1.2.7細(xì)胞因子檢測: 按照檢測脾細(xì)胞增殖的方法制備脾細(xì)胞懸液，分別離心收集24、72和96 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清液對IL-2、IL-4、IL-10和IFN-進(jìn)行細(xì)胞因子的測定。細(xì)胞因子的濃度通過ELISA試 劑盒檢測，每份樣本做3個復(fù)孔檢測。

1.2.8免疫保護(hù)率測定：末次免疫14 d后，所有小鼠進(jìn)行弓形蟲強(qiáng)毒株的攻擊實驗。每只小鼠腹腔注射約100個弓形蟲速殖子，密切觀察小鼠狀態(tài)，記錄小鼠的死亡和存活時間，繪制生存曲線。

1.2.9統(tǒng)計分析：使用SPSS軟件對脾細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子檢測的數(shù)據(jù)通過單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析。生存曲線通過Kaplan-Meier法分析DNA疫苗的免疫保護(hù)性。各組別之間的統(tǒng)計結(jié)果P值小于0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的表達(dá)

PCR成功擴(kuò)增gra14基因，大小為1 227 bp，如圖1-A所示。雙酶切連接到pVAX1載體后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中擴(kuò)增。Western blot檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞的pVAX1-gra14成功表達(dá)目的蛋白，結(jié)果如圖1-B所示，分子量約為45 kDa，與預(yù)測的蛋白分子量相同。重組 pVAX1-gra14質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)目標(biāo)抗原。

圖1 gra14基因克隆和蛋白表達(dá)Fig.1 Gene cloning and protein expression of gra14A：M：DNA marker 2 000～750 bp；1：陰性對照；2：加入模板的擴(kuò)增產(chǎn)物；3：陽性參照. B：M：蛋白marker 55～35 kDa；1：空質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293后的提取物；2：pVAX1-gra14轉(zhuǎn)入HEK293后的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物；3：原核表達(dá)的重組rGRA14。A: M: DNA marker 2 000～750 bp; 1: Negative control; 2: Amplification products adding template; 3: Positive control. B: M: Protein marker 55～35 kDa; 1: The lysate of HEK293 transformed with empty pVAX1 vector; 2: The lysate of HEK293 transformed with pVAX1-gra14; 3 Purified rTgGRA14 of T. gondii expressed in E. coli.

2.2 總IgG抗體及IgG抗體亞型的檢測

通過ELISA間接法檢測免疫后小鼠血清中的特異性抗弓形蟲抗體。結(jié)果顯示如圖2-A，實驗組小鼠免疫接種14 d后可以檢測到特異性抗弓形蟲GRA14的抗體。實驗組小鼠特異性抗體的產(chǎn)量隨著后續(xù)免疫次數(shù)的增加而不斷升高，末次免疫后，實驗組小鼠血清IgG水平顯著高于三組對照組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而三組對照組的小鼠體內(nèi)特異性抗體水平無明顯升高。

末次加強(qiáng)免疫14 d后，通過ELISA檢測IgG抗體亞型。圖2-B中所示，實驗組小鼠血清中IgG1和IgG2a亞型抗體均高于三組對照組小鼠的抗體效價(P<0.05)，并且IgG2a型抗體的產(chǎn)量要相對高于IgG1型抗體。對照組中IgG抗體亞型的檢測結(jié)果沒有顯著差異(P>0.05)。

圖2 特異性IgG抗體和IgG亞型抗體的檢測Fig.2 Detection of specific IgG antibodies and IgG subclass antibodiesA：BALB/c小鼠血清中特異性抗弓形蟲GRA14抗體的檢測，血清樣本取樣于第0、14、28、42 d免疫后。B：末次免疫14 d后BALB/c小鼠血清中特異性抗弓形蟲GRA14亞型抗體的檢測，檢測結(jié)果以450 nm下的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)差(n=10)來表示；統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(P<0.05)以星號標(biāo)注。A: Determination of specific anti-TgGRA14 antibodies in the sera of BALB/c mice. Serum samples were collected at 0, 14, 28 and 42 days post-primary immunization. B: Determination of the specific anti-TgGRA14 IgG subclass profile in the sera of immunized BALB/c mice 14days after the last immunization. Results are expressed as means of the OD450 value and the standard deviation (n=10); statistically significant differences (P < 0.05) are indicated by an asterisk (*).

2.3 脾細(xì)胞的體外增殖反應(yīng)

第3次免疫結(jié)束14 d后，每組取5只小鼠各取脾臟細(xì)胞評估其增殖反應(yīng)的情況。結(jié)果如表1所示，接種pVAX1-gra14的實驗組小鼠的脾細(xì)胞刺激因子(SI)為1.37±0.23，顯著高于三組對照組(P<0.05)，表明脾細(xì)胞經(jīng)可溶性抗原刺激后有較為強(qiáng)烈的增殖反應(yīng)。而經(jīng)PBS、pVAX1免疫和空白對照組小鼠的SI值分別是：0.62±0.01,0.55±0.02和0.64±0.05，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 細(xì)胞因子檢測

各組小鼠脾細(xì)胞懸浮液經(jīng)可溶性抗原刺激后，分別在不同時間段提取上清液測量所產(chǎn)生的γ-干擾素(IFN-)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)和白細(xì)胞介素10(IL-10)。表1所示，經(jīng)pVAX1-gra14免疫后的實驗組小鼠分泌大量的細(xì)胞因子，與三組對照組的細(xì)胞因子有顯著性差異(P<0.05)。對照組之間的細(xì)胞因子沒有顯著差異(P>0.05)。實驗組Th1型細(xì)胞因子(IFN-，IL-2)和Th2型細(xì)胞因子(IL-4，IL-10)均有產(chǎn)生，表明小鼠接種pVAX1-gra14免疫后產(chǎn)生Th1/Th2混合型的免疫反應(yīng)，這和IgG抗體亞型的分析結(jié)果相一致。

表1 經(jīng)pVAX1-gra14免疫后小鼠的細(xì)胞因子產(chǎn)量和脾細(xì)胞增殖結(jié)果Tab.1 Cytokine production and the proliferative response of splenocytes from BALB/c mice immunized with pVAX1-gra14

差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。SI指脾細(xì)胞刺激指數(shù)。
* Significant difference,P< 0.05. SI: Splenocytes stimulation index.

2.5 DNA疫苗的免疫保護(hù)性

為檢測pVAX1-gra14免疫對抵抗弓形蟲感染的免疫保護(hù)能力，在末次加強(qiáng)免疫14 d后對小鼠進(jìn)行弓形蟲強(qiáng)毒株攻擊實驗，腹腔注射100個弓形蟲速殖子，觀察和記錄各組小鼠的生存時間。結(jié)果顯示，三組對照組小鼠的生存時間沒有顯著性差別，小鼠均在弓形蟲感染后第5 d開始死亡，至第7 d三組對照組的小鼠全部死亡。但經(jīng)pVAX1-gra14免疫后的實驗組小鼠在攻擊實驗后直到第12 d才出現(xiàn)死亡，到第15 d全部死亡，平均生存時間為14.1±1.3 d。實驗組小鼠的生存時間比三組對照組顯著延長(P<0.05)。各組小鼠在攻擊感染后的生存曲線如圖3所示。

圖3 攻擊后的小鼠生存曲線Fig.3 Survival curves of BALB/c mice after challenge末次免疫14 d后各組小鼠接受100只速殖子攻擊實驗的生存曲線。每組10只小鼠。統(tǒng)計學(xué)顯著性差異用星號標(biāo)注。Survival curves of BALB/c mice injected with PBS, pVAX1, pVAX1-gra14 and the blank group, challenged with 100 tachyzoites of T. gondii RH strain 14 days after the last immunization. Each group comprised 10 mice. Statistically significant differences (P<0.05) are showed by an asterisk.

3 討論

近年來，弓形蟲疫苗研究已有較多的進(jìn)展，但不同實驗中所選用的弓形蟲抗原基因在免疫保護(hù)力上存在較大的差異。尋找具有更強(qiáng)免疫原性的抗原基因以提高弓形蟲疫苗的免疫保護(hù)效果，將是今后弓形蟲疫苗研究的重要方向之一。

致密顆粒蛋白在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞后從致密顆粒釋放入納蟲泡，定位于納蟲泡膜上，是組成納蟲泡膜的組成部分(Huangetal.，2013)，同時GRAs蛋白又多具有較強(qiáng)的免疫原性(Zhangetal.，2014；Huetal.，2015)。致密顆粒蛋白家族中的GRA14主要有6個α-螺旋、3個β折疊，經(jīng)過3次跨膜，可以在納蟲泡之間穿梭，進(jìn)入到宿主細(xì)胞內(nèi)，并且在不同蟲株之間有高達(dá)99%以上的保守性，具有4個B細(xì)胞的抗原表位(Romeetal.，2008；Chenetal.，2013)。這都表明GRA14是一個潛在的保護(hù)性抗原。

在本研究中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAX1-gra14接種小鼠免疫后，血清中特異性IgG抗體的水平隨著接種次數(shù)的增加而顯著增高，而對照組相應(yīng)血清中IgG水平無明顯變化。在抗體亞型的檢測中，同時檢測到IgG2a和IgG1，實驗組的抗體亞型產(chǎn)量明顯高于對照組(P<0.05)，并且IgG2a的表達(dá)量要略高于IgG1。表明pVAX1-gra14誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1/Th2混合型的免疫反應(yīng)。實驗組小鼠的細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10)水平明顯高于對照組(P<0.05)，而其中又以IFN-γ和IL-2最為顯著，這與之前的研究認(rèn)為IFN-γ是抵抗弓形蟲感染中的重要細(xì)胞因子(Dautuetal.，2007)的研究相一致。以上結(jié)果表明，弓形蟲GRA14可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生高效的體液免疫和細(xì)胞免疫來共同抵抗弓形蟲的感染。

攻擊感染后的存活率是候選疫苗抵抗弓形蟲感染保護(hù)力的重要指標(biāo)。本研究中，我們通過對免疫后小鼠經(jīng)行弓形蟲強(qiáng)毒株的攻擊實驗來評估GRA14的免疫保護(hù)性。攻擊實驗后，pVAX1-gra14免疫組小鼠的生存時間顯著延長并高于對照組(P<0.05)，平均生存時間為14.1±1.3 d，表明TgGRA14有潛力成為新型DNA疫苗的候選之一。

本研究評估了pVAX1-gra14作為DNA候選疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效力，顯示其能誘導(dǎo)產(chǎn)生混合型Th1/Th2免疫反應(yīng)，同時產(chǎn)生高水平的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10細(xì)胞因子，并且在攻擊實驗后，免疫小鼠生存時間顯著延長。弓形蟲GRA14是一個有效的候選疫苗分子，在后續(xù)的研究中我們將尋找合適的免疫佐劑來共同免疫(Yuanetal.，2011)或是與其他有效的DNA疫苗聯(lián)合成多價核酸疫苗(Dziadeketal.，2011；Quanetal.，2012)來進(jìn)一步增強(qiáng)免疫保護(hù)力。