家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對原代FBL-3細(xì)胞增殖周期的影響*

聶守民 邢佳欣 趙瑞君** 程璟俠 劉娟娟

(1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寄生蟲教研室，太原 030001；2.山西省疾病預(yù)防控制中心病媒生物防控科，太原 030001)

家蠅幼蟲抗菌肽能有效殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無毒害作用的優(yōu)勢是當(dāng)前研究的一大熱點。隨著對家蠅幼蟲抗菌肽抗腫瘤細(xì)胞譜的認(rèn)識，它的作用機(jī)制越來越受到人們的關(guān)注。目前報道的作用機(jī)制主要有細(xì)胞膜機(jī)制、線粒體機(jī)制、細(xì)胞骨架機(jī)制和細(xì)胞周期機(jī)制(包永芬等，2011)。

FBL-3細(xì)胞為紅白血病細(xì)胞，在體外條件下經(jīng)多次傳代培養(yǎng)之后，細(xì)胞特性會發(fā)生明顯改變，細(xì)胞毒力降低，對實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性造成了干擾(吳遠(yuǎn)彬等，2010)。所以需要通過構(gòu)建小鼠模型來獲取更接近體內(nèi)生物學(xué)特性的原代FBL-3細(xì)胞進(jìn)行實驗，大大提高了實驗結(jié)果的可應(yīng)用性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對紅白細(xì)胞病FBL-3腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，但未對其作用機(jī)制進(jìn)行研究，本文模擬體內(nèi)生物學(xué)特性，現(xiàn)以原代FBL-3腫瘤細(xì)胞為對象，探究家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對其細(xì)胞增殖周期的影響，為家蠅幼蟲抗菌肽的功能研究和臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株：FBL-3細(xì)胞，本實驗室常規(guī)傳代培養(yǎng)，-80℃冰箱保存。

1.1.2三齡家蠅幼蟲：在山西省疾病預(yù)防控制中心蟲媒科的養(yǎng)蠅室內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)，為多代培養(yǎng)的純種品系。飼養(yǎng)條件：室溫20～30℃，相對濕度控制在55%左右。

1.1.3C57BL/6小鼠：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.4主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基(北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)、胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride、 PMSF)(美國Sigma公司)、生理鹽水(高壓滅菌)(華仁藥業(yè)股份有限公司)、甲醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)、乙腈(acetonitrile, ACN)分析純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、青鏈霉素混合液(10 000U/mL青霉素和1 000μg/mL鏈霉素)、碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)(美國Sigma公司)。

1.1.5主要設(shè)備：無菌操作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、CO2培養(yǎng)箱311(美國Thermo Forma公司)、奧林巴斯IX83倒置顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)、低速離心機(jī)LDS-ZA(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)、純水儀(重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司)、真空冷凍干燥機(jī)FD-1-50(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)、高壓滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、 Sep-Pak C18柱(美國Waters公司)、核酸蛋白測定儀(德國艾本德公司)、Count star自動細(xì)胞計數(shù)儀，高速低溫臺式離心機(jī)TGL-16G(上海恒勤儀器設(shè)備有限公司)、流式細(xì)胞儀(B.D Corp,USA)。

1.2 方法

1.2.1家蠅幼蟲抗菌肽粗提物的誘導(dǎo)：用2號昆蟲針蘸E．coliDH5a(大腸桿菌)菌液針刺三齡家蠅幼蟲腹后體壁，一次一蟲，誘導(dǎo)后置于新鮮麩料內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)24 h(黨向利等，2011)。研缽預(yù)冷30 min，之后將誘導(dǎo)好的三齡家蠅幼蟲置于研缽內(nèi)，加入研磨液(含有1 mmol/L PMSF的無菌生理鹽水)，每1 g幼蟲加入1 mL研磨液，迅速、充分研磨。研磨完畢以4 ℃、12 000 r/min 離心30 min(低溫離心機(jī)應(yīng)先空轉(zhuǎn)，溫度維持在4℃)，離心重復(fù)2次，取上清液。

1.2.2固相萃取：活化：用5 mL甲醇作為強(qiáng)溶劑潤濕固定相，然后用5 mL高壓三蒸水作為弱溶劑加以平衡。上樣：上樣前將上清液再低溫離心1次(4 ℃，12 000 r/min，30 min)，之后取5 mL上清液上柱，流速控制在1mL/min。淋洗：用三蒸水作為淋洗液洗柱，去除干擾雜質(zhì)。洗脫：用三蒸水配制80 %濃度的乙腈水溶液，然后取5 mL 洗脫柱體，收集洗脫組分，-80 ℃冰箱保存24 h。最后真空凍干機(jī)干燥， 用PBS重溶，核酸蛋白儀檢測濃度。

1.2.3小鼠模型的構(gòu)建：實驗用小鼠為無特定病原體級別，生長狀況良好。挑選6周齡的C57BL/6雄性小鼠10只，體重(20±1)g。取對數(shù)生長期的FBL-3細(xì)胞，棄掉原培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，1 mL胰蛋白酶消化2～3 min，加入同等量的完全培養(yǎng)基終止消化后進(jìn)行離心(1 000 r/min，5 min)，用無血清的RPMI-1640重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整濃度為2×106個/mL。采用右腋皮下注射的方式接種6周齡的小鼠10只，每只 0.2 mL。每天觀察并記錄小鼠腫瘤生長情況。一周后可在小鼠腋下摸到明顯的的腫塊，腫塊較硬且邊緣整齊的小鼠為模型小鼠。

1.2.4原代FBL-3細(xì)胞的獲?。禾暨x兩只腫瘤長勢最好的模型小鼠，頸椎脫臼處死小鼠，75%酒精浸泡3 min。超凈工作臺內(nèi)無菌剝離小鼠腫瘤組織并剪碎，于100目網(wǎng)篩上充分研磨，研磨的同時滴加PBS沖洗。研磨后的組織液收集到15 mL離心管，1 000 r/min，離心5 min，棄上清。再加入5 mL紅細(xì)胞裂解液，靜置3 min，裂解的紅細(xì)胞發(fā)生沉淀，小心吸取上清進(jìn)行離心，用PBS洗滌3次，RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞分散均勻。CO2溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)以獲取FBL-3原代細(xì)胞。

1.2.5原代FBL-3細(xì)胞增殖周期變化的檢測：取對數(shù)生長期的原代FBL-3細(xì)胞，棄掉原培養(yǎng)液，用PBS洗兩遍，1 mL胰蛋白酶消化2～3 min，加入同等量的完全培養(yǎng)基終止消化后進(jìn)行離心(1 000 r/min，5 min)，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整濃度為2×105個/mL，接種到35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，各培養(yǎng)皿棄掉原培養(yǎng)液，PBS洗兩遍，對照皿中加入3 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，實驗組分別加入75、150、300 μg/mL的家蠅幼蟲抗菌肽粗提物1和2 mL的細(xì)胞培養(yǎng)液，每個濃度各設(shè)置3個培養(yǎng)皿。CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36 h之后消化收集各培養(yǎng)皿細(xì)胞，用PBS洗兩遍，加入2 mL 4℃預(yù)冷的70%酒精固定細(xì)胞，-20℃保存。流式細(xì)胞儀檢測前，每管細(xì)胞用PBS洗1次，加入500 μL結(jié)合液和5 μL PI，避光條件下放置30 min，振蕩混勻后上機(jī)檢測。

2 結(jié)果

2.1 模型小鼠腫瘤生長情況

本實驗選取了10只6周齡的C57BL/6雄性小鼠，其中7只小鼠長出了腫瘤，造模成功率達(dá)到了70%。第1 d，小鼠腋下出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)；第2～5 d，小鼠腫瘤結(jié)節(jié)開始生長并形成肉眼可見的腫塊；第6～8 d，腫塊基本穩(wěn)定，游標(biāo)卡尺測量腫瘤團(tuán)塊的長徑和短徑，計算腫瘤的相對體積為6 cm3。經(jīng)頸椎脫臼處死的小鼠，剝離其腋下腫塊，質(zhì)量為2.15 g。

2.2 原代FBL-3細(xì)胞的生長情況

模型小鼠的腫瘤組織經(jīng)研磨、離心后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分散均勻。37℃、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)6 h之后，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形貼壁生長，細(xì)胞密度變大(圖1)。

圖1 培養(yǎng)6 h之后的原代FBL-3(×100)Fig. 1 The primary FBL-3 was cultured after 6 h(×100)

2.3 家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對原代FBL-3細(xì)胞增殖周期的影響

由表1和表2可以看出，原代FBL-3細(xì)胞經(jīng)家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用之后其細(xì)胞周期發(fā)生了變化：G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低。作用濃度一致的前提下，隨著作用時間的延長作用效果增強(qiáng)(表1，圖2)；表2數(shù)據(jù)說明，同時作用時間一致的前提下，隨著作用濃度的提高作用效果增強(qiáng)(表2，圖3)。綜上表明，家蠅幼蟲抗菌肽粗提物對原代FBL-3細(xì)胞的作用效果呈現(xiàn)劑量-時間依賴關(guān)系。實驗結(jié)果與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。

表1 300 ug/mL 家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用后原代FBL-3細(xì)胞周期分布情況Tab.1 The cell proliferation cycle with flow cytometry analysis of FBL-3 cells treated by crude extracting of antibacterial peptides of M. domestica with concentration of 300 μg/mL

表2 不同濃度家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用36 h后細(xì)胞周期的分布情況Tab.2 The cell proliferation cycle with flow cytometry analysis of FBL-3 cells treated by crude extracting of antibacterial peptides of M. domestica with different concentrations

3 討論

白血病是一類造血干細(xì)胞異常的惡性疾病，分類很多，不管是哪一類型的白血病目前治療方式首選都是化療?；熯@種方式在治療白血病的同時也會給病人帶來嚴(yán)重的副作用：抑制骨髓造血系統(tǒng)，使白細(xì)胞和血小板數(shù)目出現(xiàn)下降；不同程度的損害肝臟細(xì)胞；對呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用等。隨著家蠅幼蟲抗菌肽研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其對多種白血病細(xì)胞株具有較強(qiáng)的抑制作用，但是作用機(jī)制尚沒有定論，所以本課題組利用家蠅幼蟲抗菌肽作用于原代FBL-3腫瘤細(xì)胞，對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，具有一定的科研意義。

圖2 300 μg/mL家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用后原代FBL-3細(xì)胞周期分布圖Fig. 2 The cell proliferation cycle with flow cytometry analysis of FBL-3 cells treated by crude extracting of antibacterial peptides of M. domestica with concentration of 300 μg/mL

圖3 不同濃度家蠅幼蟲抗菌肽粗提物作用36 h后細(xì)胞周期的分布圖Fig. 3 The cell proliferation cycle with flow cytometry analysis of FBL-3 cells treated by crude extracting of antibacterial peptides of M. domestica with concentrations

家蠅幼蟲抗菌肽是一類小分子多肽，具有分子量小、抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(Lietal.，2012)，在先天免疫等方面扮演著重要的角色(張先文等，2007)，它還能夠選擇性的作用于腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無毒副作用(Houetal.，2007)，其抗腫瘤作用已經(jīng)被諸多試驗所證實。趙瑞君等(2007)發(fā)現(xiàn)家蠅幼蟲抗菌肽能夠作用于人髓樣白血病細(xì)胞株K562、人B淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞株Daudi、人食管癌細(xì)胞株Eca-109及人膀胱癌細(xì)胞株T24等人源性腫瘤細(xì)胞，且有效殺傷作用較強(qiáng)；萬啟惠等(2008)利用家蠅幼蟲抗菌肽作用于人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株JEC，發(fā)現(xiàn)家蠅幼蟲抗菌肽對這兩種腫瘤細(xì)胞具有較好的抑制作用；魏洪等(2013)利用家蠅三齡幼蟲血淋巴40%固相萃取組分作用于肉瘤細(xì)胞株S180，結(jié)果顯示家蠅三齡幼蟲血淋巴40%固相萃取組分對該腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，細(xì)胞增殖抑制率最高可達(dá)79%。這些都是家蠅幼蟲抗菌肽抗癌的有力佐證，隨著研究的不斷深入，其抗癌譜日漸拓寬，作用機(jī)制也日益受到關(guān)注。

FBL-3細(xì)胞為小鼠紅白血病細(xì)胞，可以經(jīng)皮下、肌肉和靜脈注射的方式在C57BL/6小鼠體內(nèi)成瘤。但是，F(xiàn)BL-3細(xì)胞經(jīng)多次傳代培養(yǎng)之后，細(xì)胞毒力會發(fā)生明顯的降低，細(xì)胞特性也會有所改變，給實驗結(jié)果的可靠性帶來影響。所以我們用常規(guī)傳代培養(yǎng)的FBL-3腫瘤細(xì)胞經(jīng)右腋皮下注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)，以此來構(gòu)建小鼠模型獲取原代腫瘤細(xì)胞，恢復(fù)FBL-3細(xì)胞的生物學(xué)特性。C57BL/6小鼠為常用的實驗小鼠，其造血系統(tǒng)與人類的非常相似，而且近交系的小鼠具有遺傳背景均一、較高的穩(wěn)定性和構(gòu)建模型的周期短等優(yōu)點，所以實驗選用C57BL/6小鼠來構(gòu)建紅白血病模型具有一定的優(yōu)勢。

細(xì)胞周期即細(xì)胞生長和分裂的周期，是指細(xì)胞在一次分裂結(jié)束后到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程。腫瘤細(xì)胞增殖周期分為4個時期：DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)，G1期之前存在一個相對靜止期為G0期。傳統(tǒng)化療藥物的作用靶點主要是細(xì)胞周期，通過阻滯細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(黃煒煒等，2012)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)家蠅幼蟲抗菌肽作用原代FBL-3細(xì)胞后，其細(xì)胞增殖周期發(fā)生了改變：G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低。表明，家蠅幼蟲抗菌肽粗提物使原代FBL-3腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖周期阻滯于G0/G1期，從而抑制了S期DNA的合成，這種作用效果呈現(xiàn)劑量-時間依賴關(guān)系。金小寶(2013)等研究發(fā)現(xiàn)家蠅抗菌肽Cecropin能使人肝癌BEL-7402細(xì)胞周期發(fā)生改變：G0/G1與G2/M期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例升高。雖然與本實驗結(jié)果不盡相同，但都說明家蠅抗菌肽能夠作用于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，從而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。家蠅幼蟲抗菌肽的作用機(jī)制并不僅限于阻滯細(xì)胞周期，還存在其他機(jī)制，可能是幾種不同作用機(jī)制協(xié)同發(fā)揮作用，將在以后的實驗作進(jìn)一步的研究。