歸芪益元膏對(duì)12C6+束輻射旁效應(yīng)肺損傷大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制

馬天星，李金田,2*，李娟，張毅，梁建慶2,，古常軍，張悅

1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，蘭州 730101；2敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000；3甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730101

近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤首位。美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)最新統(tǒng)計(jì)顯示，肺癌占全球惡性腫瘤發(fā)病總數(shù)的11.6%，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的18.4%，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅[1]。肺癌的治療主要基于手術(shù)、放療和化療[2]。目前，重離子(12C6+)束治療癌癥代表了核醫(yī)學(xué)放射治療領(lǐng)域的最先進(jìn)技術(shù)，可精確定位到腫瘤的核心，并提供高密度質(zhì)子束照射。重離子(12C6+)束對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用較普通X線強(qiáng)，對(duì)周圍正常組織結(jié)構(gòu)的損害輕，不良反應(yīng)少，可實(shí)現(xiàn)療效最大化，但治療過(guò)程中腫瘤周圍的正常組織和器官容易受到不同程度的照射，從而導(dǎo)致暴露部位受到損傷。而未受輻射的正常組織細(xì)胞發(fā)生與受輻射組織細(xì)胞相同的生物學(xué)效應(yīng)，即輻射旁效應(yīng)(radiation-induced bystander effect，RIBE)[3]，導(dǎo)致正常組織細(xì)胞DNA損傷并產(chǎn)生自由基，甚至引發(fā)免疫系統(tǒng)功能改變及造血系統(tǒng)損害[4-5]。根據(jù)RIBE的致病特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)及病理演變過(guò)程，本課題組將RIBE損傷歸于中醫(yī)“火熱毒邪”致病范疇。歸芪益元膏以程鐘齡之《醫(yī)學(xué)心悟》中黃芪湯為底方，加甘肅道地藥材岷歸得出，全方共7味藥，即黃芪、當(dāng)歸、人參、熟地、枸杞子、麥冬、五味子，共奏固本培元、養(yǎng)血活血、益氣滋陰之功效。本研究旨在探討歸芪益元膏對(duì)RIBE肺損傷大鼠的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗體(GR3237963-2)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；p-Smad3抗體(GTX32214)、Smad6抗體(GTX13727)、兔抗IgG抗體(GTX213110-05)購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司；高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(20161020)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(20170301)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；熒光定量試劑盒(L006363A)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(L009434B)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子研究裝置(HIRFLCSR)、D37520型低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Kendro公司；PRO200型組織勻漿器購(gòu)自美國(guó)Bio-Gen公司；041BR 109973型電泳儀、C1000型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；KD-BM包埋機(jī)購(gòu)自浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司。

1.2 藥物制備 歸芪益元膏方中原藥材(包括黃芪、當(dāng)歸、熟地、麥冬、人參、枸杞、五味子)由甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室魏舒暢教授提供并鑒定質(zhì)量，符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)。按照規(guī)定的劑量稱取藥材，以水為溶劑萃取2次，首次、第二次分別為中藥材總劑量的8倍和6倍，每次提取時(shí)長(zhǎng)2 h。將每次提取的藥物溶液合并，用300目濾布過(guò)濾，將濾液減壓濃縮后，加入制劑輔料，制備為膏劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 S P F 級(jí)W i s t a r 雄性大鼠7 0 只，體重(2 0 0±2 0) g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0002]，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫濕度符合標(biāo)準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、輻射24 h組、歸芪益元膏+輻射24 h組、歸芪益元膏24 h組、輻射7 d組、歸芪益元膏+輻射7 d組、歸芪益元膏7 d組，每組10只。在12C6+束輻射前，各歸芪益元膏組和歸芪益元膏+輻射組給予歸芪益元膏灌胃，其余組給予生理鹽水灌胃，1次/d，共14 d。給藥劑量按照人與大鼠的給藥劑量折算系數(shù)及計(jì)算方法計(jì)算[大鼠劑量=人臨床劑量/體重(kg)×6.3]，具體如表1所示。照射前麻醉大鼠，各輻射組和歸芪益元膏+輻射組大鼠右肺予4 Gy12C6+離子束單次照射，鉛皮屏蔽身體其余部位。12C6+束輻射在中科院近代物理研究所蘭州重離子加速器研究裝置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou，HIRFL)淺層腫瘤治療端口進(jìn)行，能量為165 MeV，LET為20 keV/μm，輻射時(shí)間為2 min，吸收劑量率為2 Gy/min，總輻射劑量為4 Gy?？瞻讓?duì)照組與歸芪益元膏組給予相同方式麻醉固定，但不予照射。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

表1 歸芪益元膏給藥劑量折算系數(shù)與計(jì)算方法Tab.1 Conversion coefficient and calculation method of Guiqi Yiyuan ointment administered dose

1.4 取材及標(biāo)本制作 照射后24 h、7 d處死各組大鼠，取出左肺、右肺，用冰生理鹽水沖洗，剪切后分別放入相應(yīng)的凍存管，-80 ℃冰箱凍存。行HE染色的左肺、右肺組織分別用4%多聚甲醛溶液固定。

1.5 HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化 取4%多聚甲醛溶液固定的肺組織，經(jīng)脫水、包埋、切片、水化、染色、分化、返藍(lán)、脫水、封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)左右肺組織中TGF-β1、Smad6 mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取肺組織總RNA，檢測(cè)RNA的濃度與純度，取2 μg RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用三步法擴(kuò)增TGF-β1、Smad6 mRNA。PCR反應(yīng)體系為20 μl：Hieff? qPCR SYBR Green Master Mix 10 μl、正向引物(10 μmol/L)0.4 μl、反向引物(10 μmol/L) 0.4 μl、cDNA 2 μl、無(wú)菌超純水7.2 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物由北京博歐德生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，并在GeneBank上核對(duì)證實(shí)。引物序列如表2所示。

表2 Q-PCR引物序列Tab.2 Primer sequences of Q-PCR

1.7 Western blotting檢測(cè)左右肺組織中TGF-β1、p-Smad3、Smad6蛋白表達(dá)水平 肺組織加RIPA裂解液研磨，勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心30 min，取上清，測(cè)定總蛋白濃度；每30 g蛋白煮沸6 min，行12% SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠30 min(80 V)，分離膠90 min(120 V)，轉(zhuǎn)膜，4 ℃封閉過(guò)夜，孵育一抗GAPDH(1:1000)、TGF-β1(1:1000)、p-Smad3(1:500)、Smad6(1:1000)，孵育二抗(1:5000)，洗膜后顯色1 min，曝光。使用Image Lab軟件分析各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)組間比較采用單因素方差(One-way ANOVA)分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠左右肺組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組大鼠雙肺肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)清晰，無(wú)淤血及出血，間質(zhì)無(wú)增寬。輻射24 h組雙肺肺泡間隔增大，右肺未見(jiàn)明顯纖維增生及可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有輕微出血及肺泡間質(zhì)增生；左肺出現(xiàn)部分纖維增生，出血較多，肺泡間質(zhì)增生。歸芪益元膏+輻射24 h組雙肺部分肺泡結(jié)構(gòu)及形態(tài)大致正常，纖維增生出現(xiàn)，部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡間隔斷裂，肺泡腔內(nèi)無(wú)充血，無(wú)滲出物。歸芪益元膏24 h組雙肺肺泡腔與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異，無(wú)出血情況。輻射7 d組右肺部分肺泡間隔發(fā)生斷裂，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)纖維增生，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；左肺出現(xiàn)肺泡間隔斷裂，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，出現(xiàn)纖維增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷程度較右肺輕。歸芪益元膏+輻射7 d組右肺部分肺泡腔縮小，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)充血；左肺肺泡間隔明顯增寬。歸芪益元膏7 d組雙肺未見(jiàn)纖維增生，肺泡結(jié)構(gòu)整齊，肺泡間隔無(wú)斷裂(圖1)。

圖1 各組大鼠左右肺組織病理學(xué)變化(HE ×200)Fig.1 Pathological changes in left and right lung of rats in each group (HE ×200)

2.2 各組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad6 mRNA表達(dá)水平比較 Q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，各輻射組和各歸芪益元膏+輻射組大鼠左右肺組織中TGF-β1mRNA表達(dá)水平升高，右肺Smad6 mRNA表達(dá)水平降低，左肺Smad6 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，各歸芪益元膏組大鼠右肺Smad6 mRNA表達(dá)水平降低，左肺Smad6 mRNA表達(dá)水平升高；右肺TGF-β1mRNA表達(dá)水平升高，左肺歸芪益元膏24 h組表達(dá)水平降低，歸芪益元膏7 d組表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與輻射24 h組比較，輻射7 d組大鼠左右肺組織中TGF-β1mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與相同時(shí)間點(diǎn)輻射組比較，歸芪益元膏+輻射組大鼠左右肺組織中TGF-β1mRNA表達(dá)水平降低，Smad6 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠左右肺組織中TGF-β1、Smad6 mRNA表達(dá)水平比較(±s, n=10)Tab.3 Comparison of TGF-β1 and Smad6 mRNA levels between right and left lung tissues of rats in each group (±s, n=10)

表3 各組大鼠左右肺組織中TGF-β1、Smad6 mRNA表達(dá)水平比較(±s, n=10)Tab.3 Comparison of TGF-β1 and Smad6 mRNA levels between right and left lung tissues of rats in each group (±s, n=10)

TGF-β1. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；與空白對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與輻射24 h組比較，(2)P<0.05；與輻射7 d組比較，(3)P<0.05。

組別Smad6TGF-β1右肺左肺右肺左肺空白對(duì)照組1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00輻射24 h組0.45±0.04(1)1.02±0.03(1)1.44±0.04(1)1.22±0.03(1)歸芪益元膏+輻射24 h組0.69±0.03(1)(2)1.33±0.07(1)(2)1.34±0.05(1)(2)1.18±0.02(1)(2)歸芪益元膏24 h組0.97±0.01(1)1.58±0.07(1)1.10±0.03(1)0.99±0.02(1)輻射7 d組0.37±0.07(1)1.13±0.06(1)1.50±0.04(1)(2)1.32±0.04(1)(2)歸芪益元膏+輻射7 d組0.66±0.02(1)(3)1.56±0.09(1)(3)1.25±0.05(1)(3)1.20±0.01(1)(3)歸芪益元膏7 d組0.98±0.02(1)1.67±0.06(1)1.03±0.03(1)1.04±0.03(1)

2.3 各組大鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad3、Smad6蛋白表達(dá)水平比較 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，各輻射組和各歸芪益元膏+輻射組大鼠左右肺組織中TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)水平升高，Smad6蛋白表達(dá)水平降低，且輻射7 d組TGF-β1蛋白表達(dá)水平高于輻射24 h組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，各歸芪益元膏組大鼠右肺p-Smad3蛋白表達(dá)水平升高，左肺歸芪益元膏24 h組表達(dá)水平升高，歸芪益元膏7 d組表達(dá)水平降低；左右肺組織中Smad6蛋白表達(dá)水平升高，TGF-β1蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與相同時(shí)間點(diǎn)輻射組比較，歸芪益元膏+輻射組大鼠左右肺組織中TGF-β1、p-Smad3蛋白表達(dá)水平降低，Smad6蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2、表4)。

圖2 各組大鼠左右肺組織中TGF-β1、p-Smad3、Smad6蛋白表達(dá)水平(Western blotting)Fig.2 Expression levels of TGF-β1, p-Smad3, and Smad6 protein in leた and right lung tissues of rats in each group (Western bloはing)TGF-β1. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

表4 各組大鼠左右肺組織中TGF-β1、p-Smad3、Smad6蛋白表達(dá)水平比較(±s, n=10)Tab.4 Comparison of the expression levels of TGF-β1, p-Smad3 and Smad6 protein in left and right lung tissues among rats in each group (±s, n=10)

表4 各組大鼠左右肺組織中TGF-β1、p-Smad3、Smad6蛋白表達(dá)水平比較(±s, n=10)Tab.4 Comparison of the expression levels of TGF-β1, p-Smad3 and Smad6 protein in left and right lung tissues among rats in each group (±s, n=10)

TGF-β1. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；與空白對(duì)照組比較，(1)P<0.05；與輻射24 h組比較，(2)P<0.05；與輻射7 d組比較，(3)P<0.05。

組別p-Smad3Smad6TGF-β1右肺左肺右肺左肺右肺左肺空白對(duì)照組0.50±0.050.47±0.030.96±0.021.03±0.030.61±0.030.74±0.02輻射24 h組1.27±0.04(1)1.12±0.07(1)0.31±0.08(1)0.35±0.02(1)1.05±0.02(1)1.26±0.06(1)歸芪益元膏+輻射24 h組1.01±0.03(1)(2)0.88±0.02(1)(2)0.62±0.02(1)(2)0.46±0.02(1)(2)0.75±0.03(1)(2)1.05±0.02(1)(2)歸芪益元膏24 h組0.80±0.05(1)0.75±0.03(1)1.04±0.04(1)1.13±0.02(1)0.38±0.03(1)0.59±0.03(1)輻射7 d組1.25±0.05(1)0.94±0.02(1)0.44±0.06(1)0.45±0.19(1)1.10±0.04(1)(2)1.38±0.04(1)(2)歸芪益元膏+輻射7 d組0.91±0.06(1)(3)0.79±0.02(1)(3)0.53±0.07(1)(3)0.62±0.11(1)(3)0.81±0.02(1)(3)1.12±0.02(1)(3)歸芪益元膏7 d組0.73±0.03(1)0.39±0.06(1)1.10±0.04(1)1.20±0.03(1)0.42±0.07(1)0.71±0.05(1)

3 討 論

RIBE是指在照射腫瘤細(xì)胞時(shí)，周圍的正常細(xì)胞模仿直接照射的細(xì)胞的放射行為，該行為產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)、外泌體和各種細(xì)胞因子將輻射損傷擴(kuò)散到正常細(xì)胞和組織，其引發(fā)的深度基因組損傷會(huì)增高細(xì)胞凋亡率并導(dǎo)致DNA損傷，甚至誘導(dǎo)繼發(fā)性癌癥的發(fā)生[6-7]。近年來(lái)，RIBE的機(jī)制研究主要包括三類：ROS與細(xì)胞因子的相互作用[8]、細(xì)胞間隙連接通訊作用[9]、外泌體的作用[10]。丁香等[11]發(fā)現(xiàn)，RIBE發(fā)生機(jī)制之一的ROS異常堆積是造成骨髓氧化應(yīng)激的主要因素。ROS通過(guò)破壞骨髓組織細(xì)胞DNA、脂肪、蛋白質(zhì)等的結(jié)構(gòu)，使其功能發(fā)生紊亂，觸發(fā)旁效應(yīng)，導(dǎo)致骨髓抑制。王萌[12]以2 Gy12C6+重離子輻照大鼠右肺，發(fā)現(xiàn)大鼠股骨骨髓細(xì)胞周期發(fā)生改變，出現(xiàn)G2/M期阻滯，表明重離子產(chǎn)生的旁效應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期下降等。梁建慶等[13-14]以8 Gy重離子照射大鼠右肺，結(jié)果顯示，旁器官左肺、左腎及右腎組織中DNA總甲基化水平下降，左肺出現(xiàn)炎癥，表明DNA受損。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，具有抗輻射作用的中藥，其機(jī)制主要包括抗氧化、修復(fù)DNA損傷、促進(jìn)造血、提升免疫功能等[15]。黃芪的化學(xué)成分主要有多糖、皂苷、黃酮類等[16]，其發(fā)揮抗癌、防輻射、抗氧化應(yīng)激等功用多由黃芪多糖這一有效成分來(lái)實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖用于癌癥放射治療具有明顯的減毒增效作用，且可對(duì)放射損傷起到保護(hù)作用[17]。趙蓉等[18]研究黃芪注射液對(duì)大鼠放射性肺損傷(radiation-induced lung injury，RILI)的保護(hù)作用發(fā)現(xiàn)，抑制p-Smad2/3和TGF-β1蛋白的表達(dá)可減緩肺纖維化的惡化，表明黃芪注射液對(duì)放射性肺炎及肺纖維化有改善作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸提取物當(dāng)歸多糖是防治肺纖維化的有效成分，能改善肺纖維化模型大鼠的各項(xiàng)肺功能，對(duì)放射損傷具有防護(hù)作用[19]。倫博書(shū)等[20]發(fā)現(xiàn)，歸芪益元膏中黃芪、當(dāng)歸、人參等具有顯著的抗輻射作用。TGF-β1/Smads信號(hào)通路激活是公認(rèn)的引起肺部損傷的原因。TGF-β1參與調(diào)控放射性肺炎發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過(guò)程，可作為RILI診斷的“開(kāi)關(guān)”性分子[21]。Smad3是激活TGF-β1信號(hào)通路的重要蛋白，其被抑制可減少膠原蛋白的合成及纖維化的形成[22]。Smad3是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體(transforming growth factor-β receptor，TGF-βR)激活的主要靶標(biāo)，磷酸化和核易位是TGF-β1/Smad信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)和放射纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)放射導(dǎo)致的纖維化起著不可替代的作用。Smad6是抑制型Smad蛋白，其活性下調(diào)與TGF-β1過(guò)表達(dá)有關(guān)，因此上調(diào)Smad6的活性可使TGF-β1分泌量減少，從而起到減輕放射性肺損傷的作用。Smad6也參與了多種信號(hào)通路及核蛋白間的相互調(diào)控作用[23-24]。蔣友芹等[25]研究了TGF-β1信號(hào)通路在輻射誘導(dǎo)的肺癌旁效應(yīng)細(xì)胞中的作用，發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達(dá)與時(shí)間呈正相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，各輻射組大鼠在4 Gy12C6+束照射右肺后，左右肺組織中TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)量在24 h、7 d均升高，且隨照射后時(shí)間延長(zhǎng)而升高，表明經(jīng)12C6+束輻射的大鼠靶組織右肺、旁組織左肺均發(fā)生炎癥損傷反應(yīng)，提示12C6+束輻射旁效應(yīng)肺損傷模型造模成功。與相同時(shí)間點(diǎn)輻射組比較，各歸芪益元膏+輻射組大鼠左右肺組織中TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)量降低，但輻射24 h組降低幅度較大，提示歸芪益元膏通過(guò)調(diào)控TGF-β1的表達(dá)，一定程度上減輕了12C6+束輻射旁效應(yīng)肺損傷。與空白對(duì)照組比較，各輻射組大鼠在4 Gy12C6+束輻射右肺后，左右肺組織中p-Smad3蛋白表達(dá)量在24 h、7 d明顯升高，但輻射24 h組升高幅度較大，分析原因?yàn)闄C(jī)體在輻射24 h后啟動(dòng)了應(yīng)激性自我修復(fù)。由此可見(jiàn)，未受輻射的左肺出現(xiàn)了與受輻射右肺類似的基因改變，表明輻射誘發(fā)了旁效應(yīng)的產(chǎn)生，而p-Smad3可能介導(dǎo)了該過(guò)程，輻射后右肺局部損傷并通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)引起旁組織左肺發(fā)生局部損傷，產(chǎn)生了右肺-左肺旁效應(yīng)。與相同時(shí)間點(diǎn)輻射組比較，各歸芪益元膏組大鼠左右肺組織中p-Smad3蛋白表達(dá)量降低，提示歸芪益元膏可通過(guò)調(diào)控TGF-β1來(lái)降低p-Smad3蛋白的表達(dá)，一定程度上抑制了12C6+束輻射旁效應(yīng)肺損傷的發(fā)生。與空白對(duì)照組比較，各輻射組大鼠在4 Gy12C6+束輻射右肺后，右肺組織中Smad6 mRNA表達(dá)量在24 h、7 d明顯降低，分析原因?yàn)镾mad6對(duì)輻射損傷組織及旁組織具有一定保護(hù)作用，但時(shí)間效應(yīng)不明顯。與相同時(shí)間點(diǎn)輻射組比較，給予歸芪益元膏提前灌胃干預(yù)后，受輻射大鼠右肺、左肺組織中Smad6 mRNA和蛋白表達(dá)量上升，分析原因?yàn)闅w芪益元膏可通過(guò)上調(diào)Smad6的表達(dá)而減緩雙肺組織中TGF-β1的釋放，進(jìn)而降低左右肺組織中Smad3的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)RIBE損傷的防護(hù)作用。

綜上所述，12C6+束輻射大鼠右肺可誘導(dǎo)右肺-左肺旁效應(yīng)發(fā)生，其機(jī)制可能與TGF-β1/Smads信號(hào)通路中TGF-β1、p-Smad3、Smad6比例失衡有關(guān)；而歸芪益元膏可調(diào)控TGF-β1、p-Smad3、Smad6的表達(dá)，從而減輕炎癥損傷，對(duì)輻射大鼠產(chǎn)生的右肺-左肺旁效應(yīng)具有一定的防護(hù)作用。但本研究受實(shí)驗(yàn)條件限制，未對(duì)Smad蛋白家族中其他相關(guān)因子及其他器官旁效應(yīng)損傷進(jìn)行探討，后續(xù)研究需要進(jìn)一步完善。