干旱脅迫對不同根型苜蓿根系生長及根際土壤細菌的影響

汪 堃,南麗麗,*,師尚禮,郭全恩

1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室, 蘭州 730070 2 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所, 蘭州 730070

苜蓿(Medicagosativa)是畜牧業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的植物蛋白資源,也是我國當前草地農(nóng)業(yè)和生態(tài)建設(shè)工程中應(yīng)用最為廣泛的草種[1],其根系類型可劃分為直根型、側(cè)根型、根蘗型和根莖型4類[2]。直根型苜?；蛟粗饕獊碜杂谧匣ㄜ俎?根莖型、側(cè)根型和根蘗型苜蓿都不同程度地具有野生黃花苜蓿的基因,其對干旱、嚴寒的抵抗力較強。

我國干旱和半干旱地區(qū)的面積約占國土面積的52.5%[3],干旱脅迫嚴重影響作物的生長和產(chǎn)量。根系是植物吸收、轉(zhuǎn)化和儲藏營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官。當出現(xiàn)干旱脅迫時,植物根系最先感知并迅速產(chǎn)生信號傳遞到各個器官,植物通過改變自身形態(tài)和生理生化特性以適應(yīng)變化的水分環(huán)境[4],進而影響根際環(huán)境[5]。根際是受植物根系及其生長活動顯著影響的土壤微域環(huán)境[6],根際微生物群落種類和數(shù)量與植物生長、繁殖密切相關(guān)[7]。干旱脅迫能調(diào)控植物根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和組成,使得某些功能菌群、有益菌群和有害菌群顯著變化[8],對土壤生物化學(xué)活性及養(yǎng)分組成與轉(zhuǎn)化、植物生長發(fā)育及抗脅迫能力有直接影響[9]。

目前對不同根型苜蓿根頸變化特征[10]、根系發(fā)育能力[11]、根系與產(chǎn)量的關(guān)系[12]、抗逆性[13- 14]進行了對比研究,但有關(guān)干旱脅迫對根系生長及根際細菌菌群結(jié)構(gòu)影響的研究鮮見報道。為此,本試驗設(shè)置水分脅迫處理,以幼苗期不同根型苜蓿根系生長及根際土壤為研究對象,利用16S rRNA基因測序技術(shù)對土壤中細菌種類及多樣性進行系統(tǒng)分析,研究不同根型苜蓿根系生長及根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)對干旱脅迫的響應(yīng),為不同根型苜蓿根際土壤菌群結(jié)構(gòu)平衡、增強脅迫耐受性提供參考,為旱地苜蓿豐產(chǎn)、高效、優(yōu)質(zhì)栽培提供依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試苜蓿有：Ⅰ.根莖型“清水”紫花苜蓿(rhizomatous rootedM.sativacv.Qingshui,QS)、Ⅱ.直根型“隴東”紫花苜蓿(tap rootedM.sativacv.Longdong,LD)、Ⅲ.根蘗型“公農(nóng)4號”雜花苜蓿(creeping rootedM.varia Martin.cv.Gongnong No.4,GN),其中Ⅲ的種子由吉林省農(nóng)科院提供,其余均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.2 試驗設(shè)計

在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院植物生長室,采用沙培盆栽試驗,選用12 cm(高)×9.2 cm(盆底直徑)塑料盆為試驗用盆,每盆裝用去離子水洗凈、105 ℃恒溫干燥箱烘48 h后的沙子1 kg,播種飽滿、均勻、無病蟲害的苜蓿種子35粒,播種后每盆定量澆灌300 mL Hoagland營養(yǎng)液,待長出兩片真葉時進行間苗,每盆留苗18株。于幼苗生長至第42天始干旱脅迫。試驗采用兩因素完全隨機設(shè)計,因素A為3個不同根型苜蓿品種；因素B為不同水分處理,分別為對照(Control,CK)、中度(Medium,M)和重度(Severe,S)水分脅迫,3個處理的土壤含水量分別為河沙最大持水量的65%—75%、45%—55%和25%—35%,即不同處理每隔2 d分別澆灌257、128、77 mL Hoagland營養(yǎng)液,每個處理重復(fù)4次,共36盆。處理15 d后采集苜蓿幼苗根系,抖掉根系外圍河沙,用毛刷取緊貼在根系上的河沙,每個處理的所有重復(fù)混合后作為根際土,保存在-80℃冰箱中用于土壤微生物總DNA提取。

1.3 測定方法

采用烘干法測定10個植株葉莖、根系干物質(zhì)量并計算根冠比(根系干物質(zhì)量/葉莖干物質(zhì)量),將葉莖、根系置于60 ℃的恒溫干燥箱烘48 h,烘至恒重。將各處理的根系用蒸餾水沖洗干凈,采用臺式掃描儀對根系進行掃描并將圖像存入電腦,采用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)軟件可以獲得根系總長度、根系總表面積、根系平均直徑、根體積和根尖數(shù)等。根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定[15]。

土壤總DNA提取及細菌16S rRNA基因擴增：采用CTAB方法對樣本的基因組DNA進行提取,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量,取適量的樣品于離心管中,使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板,根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶Barcode的特異引物,New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,和高效高保真酶進行PCR,確保擴增效率和準確性。利用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)與806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)擴增其V4區(qū)基因片段,每個樣品3次重復(fù)。PCR擴增反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性1 min,98 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環(huán),最后在72 ℃下延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過Hiseq 2500平臺(Illumina,SanDiego,CA,USA)進行測序(諾禾致源生物信息科技有限公司,北京)。下機數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME(v1.8.0)軟件過濾、拼接、去除嵌合體后[16- 17],得到可用于后續(xù)分析的有效序列(effective tags)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA),用Duncan法對數(shù)據(jù)進行多重比較。利用Uparse軟件對樣品的有效序列進行OTUs聚類(Operational Taxonomic Units,相似度97%以上),用Mothur方法[18]與Silva軟件的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[19]進行物種注釋(設(shè)定閾值為0.8—1.0)；采用MUSCLE(3.8.31)軟件[20]進行快速多序列比對,采用Qiime(1.9.1)軟件計算Alpha多樣性指數(shù),使用R軟件(2.15.3)繪制稀釋曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 各根型苜蓿根系生長差異分析

由表1可知,隨脅迫程度增加,各根型苜蓿的株高、莖葉生物量、根系干重、根系活力、根體積、根系總長均顯著降低(P<0.05),重度脅迫下,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的株高較CK下降了21.05%、26.66%和27.29%,莖葉生物量較CK降低了31.52%、29.37%和31.99%,根系干重較CK減少了23.71%、23.22%和42.82%,根系活力較CK降低了76.63%、58.49%和75.70%,根體積較CK下降了38.15%、35.20%和49.38%,根長較CK減少了7.49%、4.47%和14.57%,且Ⅰ的株高、根系活力顯著大于Ⅱ和Ⅲ(P<0.05),Ⅱ的根長顯著大于Ⅰ和Ⅲ(P<0.05),Ⅱ和Ⅲ的根系干重顯著高于Ⅰ(P<0.05)；不同根型苜蓿的根冠比隨脅迫程度加劇呈先增加后下降趨勢,在中度脅迫時達到最大值,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的根冠比較CK分別增加了30.05%、32.94%和18.51%(P<0.05),且Ⅰ的根冠比顯著小于Ⅱ和Ⅲ(P<0.05)；根系平均直徑、根系總表面積各根型苜蓿間差異不顯著；Ⅰ的根尖數(shù)隨脅迫程度加劇呈先上升后下降趨勢(P<0.05),而Ⅱ和Ⅲ的根尖數(shù)呈顯著下降趨勢(P<0.05),重度脅迫下,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的根尖數(shù)較CK分別降低了16.34%、24.24%和51.82%,且Ⅱ的根尖數(shù)顯著高于Ⅰ和Ⅲ(P<0.05)。

2.2 根際土壤細菌群落豐度與Alpha多樣性分析

由表2可知,通過高通量測序,過濾掉低質(zhì)量的序列后,QS.CK、QS.M、QS.S、LD.CK、LD.M、LD.S、GN.CK、GN.M、GN.S的有效序列在55943—67703范圍內(nèi)變動,OTU數(shù)分別為711、785、701、645、752、707、662、658、762。由圖1可知,各樣品文庫的覆蓋度均在98%以上,并結(jié)合樣品稀釋曲線均趨于平緩,說明本研究測序數(shù)據(jù)合理,能夠準確反映出土壤細菌群落的真實信息。各處理Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均在中度脅迫下最大,且處理間差異不顯著；Simpson和Shannon-wiener指數(shù)各處理間差異不顯著。由圖2可知,所有樣品共有OTUs數(shù)目為493個,其中QS.CK、QS.M、QS.S、LD.CK、LD.M、LD.S、GN.CK、GN.M、GN.S所特有的OTUs數(shù)目分別為38、384、28、26、27、21、18、25、25個。

表1 干旱脅迫對不同根型苜蓿根系生長的影響

表2 樣品序列數(shù)統(tǒng)計、豐富度與多樣性指數(shù)

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for samples

圖2 樣品花瓣圖Fig.2 Flower diagrams of samples

2.3 根際土壤細菌群落分布

由圖3可知,各處理細菌群落相對豐度前十的細菌門分別為：變形菌門(Proteobacteria)(54.44%—77.59%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(1.60%—24.43%)、類桿菌門(Bacteroidota)(4.71%—13.08%)、放線菌門(Actinobacteria)(2.66%—3.38%)、厚壁菌門(Firmicutes)(1.97%—4.19%)、unidentified_Bacteria(1.47%—3.75%)、Kapabacteria(0.21%—3.53%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(0.34%—1.93%)、蛭弧菌門(Bdellovibrio)(0.38%—1.04%)、Candidatus_Kaiserbacteria(0.02%—0.58%),共占細菌總數(shù)的92.97%—96.90%。其中變形菌門、綠彎菌門、類桿菌門、放線菌門和厚壁菌門占細菌總數(shù)的85.09%—92.40%,說明這5個門的細菌為優(yōu)勢菌群。不同處理細菌在門分類水平上,相對豐度有一定的差異。隨脅迫程度增加,與CK相比,變形菌門、厚壁菌門、unidentified_Bacteria和Kapabacteria顯著增加(P<0.05),類桿菌門、放線菌門、疣微菌門、蛭弧菌門和Candidatus_Kaiserbacteria均先增加后降低(P<0.05),而綠彎菌門顯著降低(P<0.05)。

圖3 門分類水平下的細菌群落相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial community at phylum level

由圖4可知,各處理細菌群落相對豐度前十的細菌屬分別為：爬管菌屬(Herpetosiphon)、假單孢菌屬(Pseudomonas)、Pseudoxanthomonas屬、副球菌屬(Paracoccus)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、Shinella屬、偶氮螺菌屬(Azospirillum)、Devosia屬、SWB02屬、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium),共占細菌總屬的43.05%—61.86%,其他類群的相對豐度占38.14%—56.95%。細菌在屬分類水平上,各處理相對豐度有一定的差異。隨脅迫程度增加,與CK相比,爬管菌屬、假單孢菌屬和副球菌屬均顯著降低(P<0.05),Pseudoxanthomonas、Devosia、SWB02和中慢生根瘤菌屬均顯著增加(P<0.05),纖維弧菌屬、Shinella和偶氮螺菌屬先增加后降低(P<0.05)。

圖4 屬分類水平下的細菌群落相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial community at genus level

3 討論

根系形態(tài)是描述植物根系隨環(huán)境變化的重要指標。丁紅等[21]研究表明,干旱脅迫下根長、根系表面積和根體積較大有利于植物大范圍吸收土壤水分和養(yǎng)分；厲廣輝等[22]和Pirnajmedin等[23]研究認為,根干重、根體積、根總面積與品種抗旱能力呈顯著正相關(guān)；李文嬈等[24]研究表明,干旱脅迫顯著增加了紫花苜蓿根系表面積；張翠梅等[25]研究顯示,干旱脅迫下強抗旱苜蓿的根系總長度和根系干重顯著增加,根系總表面積變化不顯著；弱抗旱苜蓿的根系總表面積顯著下降。本研究顯示,與CK相比,隨脅迫程度加劇,各根型苜蓿的幼苗株高、地上干重、根系干重、根系活力、根系平均直徑、根體積、根系總表面積、根系總長等指標均有一定程度的減少,表明干早脅迫限制了苜蓿根系和地上部的生長,降低了苜蓿的干物質(zhì)積累,這與前人研究結(jié)論一致[26]；中重度水分脅迫使各根型苜蓿的根冠比增加,這與其他學(xué)者對小麥[27]、豌豆[28]、玉米[29]的研究結(jié)果一致,對朱槿[30]的研究結(jié)果相反。整個脅迫期間,根莖型清水紫花苜蓿的株高、根系活力及根尖數(shù)相對較高,直根型隴東紫花苜蓿的根長、根系平均直徑、根體積、根系總表面積相對較高,根蘗型公農(nóng)4號雜花苜蓿的地上干重、根系干重、根冠比相對較高。這可能是由不同根型苜蓿根系適應(yīng)或響應(yīng)干旱脅迫的形態(tài)差異造成,根系生長發(fā)育受到自身遺傳因素和外部環(huán)境的共同影響。

研究表明,根際細菌菌群參與調(diào)控植物的環(huán)境脅迫應(yīng)答[31- 33]。因而,研究細菌群落的結(jié)構(gòu),進一步篩選和接種有益菌以減輕植物適應(yīng)環(huán)境脅迫的壓力是一種成本效益較高的選擇。土壤中絕大多數(shù)微生物是不可培養(yǎng)的,高通量測序能較真實地反映環(huán)境中微生物組成[34]。本研究表明,苜蓿根際土壤細菌群落主要有變形菌門、綠彎菌門、類桿菌門、放線菌門和厚壁菌門5個優(yōu)勢菌門。這與相關(guān)學(xué)者對水稻[35]、玉米[36]、冰川棘豆[37]等植物根部土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果類似。隨脅迫程度加劇,變形菌門和厚壁菌門的相對豐度顯著升高,類桿菌門和放線菌門的相對豐度先升高后下降,綠彎菌門的相對豐度顯著降低。包含多種病原菌和固氮菌的變形菌門在各種植物根際增長速度很快,是各種植物根際細菌中的優(yōu)勢菌群[38]。變形菌還具有較好抗旱能力,特別是具有較厚的細胞壁更能抵抗水分脅迫[39],可以解釋其在干旱脅迫后明顯富集的現(xiàn)象；厚壁菌門可耐受干旱、低溫等極端條件[40],干旱脅迫使其在苜蓿根系土壤中豐度顯著升高；放線菌門產(chǎn)生的孢子能夠抵抗外界不利的環(huán)境條件[41],在中度脅迫下達到了最大；綠彎菌參與C、N、S等一系列重要生源元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程[42],干旱脅迫降低了C、N、S等生物地球化學(xué)循環(huán)過程。可見,干旱脅迫明顯影響土壤微域結(jié)構(gòu),對苜蓿根際細菌菌群的結(jié)構(gòu)具有顯著的調(diào)控作用,推測這些豐富度提高的優(yōu)勢菌群可能在干旱脅迫下,對苜蓿存活和增加脅迫耐受能力方面發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

干旱脅迫對直根型、根莖型、根蘗型苜蓿的根系生長及根際土壤細菌菌群組成均有顯著影響。與CK相比,隨脅迫程度增加各根型苜蓿的株高、地上生物量、地下生物量、根系活力、根體積、根系總長均顯著降低,根冠比先增加后下降且在中度脅迫時達到最大值。干旱脅迫均顯著增加了變形菌門、厚壁菌門、unidentified_Bacteria和Kapabacteria的相對豐度,顯著降低了綠彎菌門的相對豐度,但類桿菌門、放線菌門、疣微菌門、蛭弧菌門和Candidatus_Kaiserbacteria均先增加后降低。