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    天麻素對(duì)次黃嘌呤誘導(dǎo)小鼠急性高尿酸血癥的影響和機(jī)制研究

    2021-10-29 08:42:10褚亞慧孔維佳
    中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥 2021年26期
    關(guān)鍵詞:次黃嘌呤灌胃腎臟

    褚亞慧 孔維佳

    中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所病毒室,北京 100050

    天麻素(gastrodin,GAS)是中藥天麻的主要有效成分之一,可由天麻的根莖中提取或化學(xué)合成獲得。研究發(fā)現(xiàn)除了治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病,GAS 還具有其他多種藥理作用[1-4]。最近的研究發(fā)現(xiàn),GAS 用于四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠腎損害模型具有降尿酸(uric acid,UA)作用[5],但其機(jī)制尚不明確。高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)可導(dǎo)致痛風(fēng)和腎功能損害,并與一些代謝性疾病和循環(huán)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)以次黃嘌呤誘導(dǎo)小鼠的急性HUA,并研究了GAS 的降UA 作用和可能機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 藥品和試劑

    GAS 購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司(批號(hào):C10915097),別嘌呤醇(allopurinol,ALLO)、次黃嘌呤和羧甲基纖維素鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司,血清生化指標(biāo)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中生北控生物科技有限公司。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究有限公司。QIAsymphony RNA Kit 購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司,GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和GoTaq?qPCR Master Mix 試劑盒購(gòu)自美國(guó)promega 公司。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    雄性昆明種小鼠50 只,體重18~20 g,購(gòu)自北京康藍(lán)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0011。所有動(dòng)物于SPF 級(jí)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn),自由飲水,投喂常規(guī)嚙齒類(lèi)顆粒飼料。

    1.1.3 儀器

    7100 型全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自QIAGEN 公司,NanoDrop 2000 型超微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司,ABI 7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

    實(shí)驗(yàn)方案由醫(yī)藥生物技術(shù)研究所倫理委員會(huì)審核通過(guò),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作和流程遵循中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物教學(xué)用動(dòng)物使用指南》[8]。動(dòng)物隨機(jī)分為5 組,每組10 只,分別為正常組、模型組、GAS 200 mg/kg組、GAS 400 mg/kg 組和ALLO 10 mg/kg 組。正常組和模型組每日灌胃同等體積0.5%羧甲基纖維素鈉,其余各組每日灌胃給藥。藥物于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中溶解,灌胃體積為0.3 ml/只,持續(xù)14 d。

    第13 天晚上8∶00 所有動(dòng)物禁食,第二天上午8∶00 最后一次灌胃給藥。給藥1 h 后除正常組外其余各組動(dòng)物腹腔(intraperitoneal,i.p.)注射次黃嘌呤1000 mg/kg[9]。次黃嘌呤溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中,注射體積為0.2 ml/只。注射45 min 后[9]所有動(dòng)物眼眶取血置于離心管中,二氧化碳麻醉處死后取肝臟和腎臟置液氮中快速冷凍,然后于-80℃冰箱中凍存。

    血標(biāo)本于室溫靜置2 h 后以3000 rpm(r=7 cm)離心10 min 分離血清。每個(gè)血清標(biāo)本取0.2 ml,分別用相應(yīng)試劑盒并參考說(shuō)明書(shū)在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定UA、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)等生化指標(biāo)。

    1.2.2 肝臟XOD 活力測(cè)定

    每只小鼠稱取約0.2 g 肝組織,以0.9%生理鹽水按重量體積比1∶9 制成10%勻漿液。于3000 r/min,半徑7 cm 離心10 min,然后取上清按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)結(jié)束后以分光光度計(jì)測(cè)量530 nm 的吸光度,結(jié)果以U/g 肝組織表示。

    1.2.3 組織RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

    以試劑盒提取腎組織總RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系、溫度和時(shí)間等條件參考文獻(xiàn)報(bào)道[10],反應(yīng)結(jié)束后樣品置-20℃凍存。定量PCR 的基因特異性引物見(jiàn)表1,PCR 反應(yīng)體系、條件和循環(huán)數(shù)參考文獻(xiàn)報(bào)道[10]。反應(yīng)結(jié)束后以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參對(duì)目的基因包括尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(urate transporter 1,URAT1) 和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(organic anion transporter 1,OAT1)(表1)進(jìn)行校正,并以文獻(xiàn)報(bào)道[10]的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果以正常組的倍數(shù)表示。

    表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 小鼠引物(5′-3′)

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 GAS 減輕次黃嘌呤誘導(dǎo)的小鼠急性HUA

    模型組小鼠血清UA 水平高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。劑量為200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 灌胃給藥14 d 使小鼠血清UA 水平下降(與模型組比較,P<0.05 或P<0.01)。作為陽(yáng)性對(duì)照藥,劑量為10 mg/kg 的ALLO 灌胃給藥14 d 使小鼠血清UA 水平下降(與模型組比較,P<0.001),與正常組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組的BUN、Scr、ALT 和AST 比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

    表2 GAS 和ALLO 對(duì)急性HUA 小鼠血清UA、腎功能和肝功能指標(biāo)的影響(±s)

    表2 GAS 和ALLO 對(duì)急性HUA 小鼠血清UA、腎功能和肝功能指標(biāo)的影響(±s)

    與正常組比較,aaaP<0.001,與模型組比較,bP<0.05、bbP<0.01、bbbP<0.001

    組別UA(μmol/L)BUN(mmol/L)SCr(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)正常組(n=10)模型組(n=10)GAS 200 mg/kg 組(n=10)GAS 400 mg/kg 組(n=10)ALLO 10 mg/kg 組(n=10)163.5±21.1 620.8±124.4aaa 504.4±47.6b 373.8±43.1bb 140.5±28.1bbb 6.77±0.72 6.99±0.74 6.43±0.58 6.91±0.70 6.76±0.33 52.20±4.83 56.83±6.93 54.05±4.87 54.81±5.19 56.80±8.46 34.82±4.93 33.09±5.20 32.50±5.39 33.57±4.17 35.33±3.80 131.7±15.9 136.2±16.9 128.3±13.2 133.0±14.1 138.4±19.9

    2.2 GAS 抑制小鼠肝臟XOD 活力

    模型組小鼠肝臟XOD 活力高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS使小鼠肝臟XOD 活力下降(與模型組比較,P<0.05 或P<0.01)。ALLO 使小鼠肝臟XOD 活力下降(與模型組比較,P<0.01),與正常組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

    與正常組比較,aaP<0.01;與模型組比較較,bP<0.05、bbP<0.01

    2.3 GAS 下調(diào)小鼠腎臟URAT1 而上調(diào)OAT1 的mRNA 表達(dá)

    模型組小鼠腎臟URAT1 的mRNA 表達(dá)水平高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2A),而OAT1的mRNA 表達(dá)水平低于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2B)。200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 使小鼠腎臟URAT1 的mRNA 水平減少(與模型組比較,P<0.05 或P<0.01)(圖2A),同時(shí)使OAT1 的mRNA水平增加(與模型組比較,P<0.05 或P<0.01)(圖2B)。ALLO 使小鼠腎臟URAT1 和OAT1 的mRNA 表達(dá)水平恢復(fù)(與模型組比較,P<0.01),與正常組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖2 GAS 和ALLO 對(duì)急性HUA 小鼠腎臟URAT1(A)和OAT1(B)mRNA 表達(dá)水平的影響(n=10,±s)

    3 討論

    本研究探討了GAS 對(duì)小鼠急性HUA 的作用,并報(bào)道了GAS 降UA 的可能機(jī)制。次黃嘌呤是UA 生物合成的前體物質(zhì)之一[11],本實(shí)驗(yàn)通過(guò)i.p.注射次黃嘌呤成功復(fù)制了小鼠急性HUA 模型,并發(fā)現(xiàn)劑量為200 mg/kg 和400 mg/kg 的GAS 灌胃給藥具有明顯的降UA 作用,能有效減輕小鼠HUA。該結(jié)果與近期Ma等[5]的研究結(jié)果相一致,提示GAS 對(duì)不同因素誘導(dǎo)的小鼠血清UA 升高均具有抑制作用。

    XOD 主要分布于肝臟和腸道等組織,是UA 合成的關(guān)鍵酶,也是ALLO 等降UA 藥物的主要作用靶點(diǎn)之一[11]。本研究結(jié)果顯示,GAS 使小鼠肝臟XOD的活力下降,提示GAS 能抑制肝臟中UA 的合成。另有研究發(fā)現(xiàn),在體外無(wú)細(xì)胞的反應(yīng)體系中,濃度低至0.1 μmol/L 的GAS 即能有效抑制XOD 的催化活性,使UA 的產(chǎn)生量明顯減少[12]。本文的結(jié)果與之符合,并進(jìn)一步證明了GAS 在體內(nèi)對(duì)XOD 活力的抑制作用。

    URAT1 和OAT1 分別參與腎小管對(duì)UA 的重吸收和分泌,在維持體內(nèi)尿酸代謝平衡方面發(fā)揮重要作用[13-14]。目前,URAT1 抑制劑是降尿酸和抗痛風(fēng)藥物的研發(fā)熱點(diǎn),并且已有多個(gè)候選藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[15-16]。本研究結(jié)果顯示,小鼠i.p.注射次黃嘌呤后腎組織URAT1 的mRNA 表達(dá)升高而OAT1 的mRNA表達(dá)下降,提示腎臟對(duì)UA 的重吸收增加而分泌減少。GAS 灌胃給藥后明顯下調(diào)URAT1 的mRNA 表達(dá)同時(shí)上調(diào)OAT1 的mRNA 表達(dá),說(shuō)明GAS 能抑制腎臟對(duì)UA 的重吸收并增加其分泌,從而促進(jìn)UA 從體內(nèi)排泄。

    目前臨床常用的降尿酸藥物有ALLO、非布司他、苯溴馬隆、丙磺舒等。這些藥物通常有較多不良反應(yīng),如過(guò)敏反應(yīng)、藥物性肝炎、消化道反應(yīng)、血象異常等,并不適合長(zhǎng)期應(yīng)用[17-19]。臨床上口服GAS 不良反應(yīng)輕微且多呈一過(guò)性,大多無(wú)需停藥或特殊處理,且未見(jiàn)報(bào)道有肝腎功能損害等嚴(yán)重不良反應(yīng)[20-21]。GAS的良好安全性為其進(jìn)一步研發(fā)用于新的臨床適應(yīng)證奠定了基礎(chǔ)。

    綜上所述,GAS 灌胃用于次黃嘌呤誘導(dǎo)的小鼠急性HUA 能有效降低血清UA 濃度,其機(jī)制可能與抑制肝臟XOD 活力以及調(diào)控腎臟URAT1 和OAT1 的mRNA 表達(dá)有關(guān),具有一定的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

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