梭梭 HaNAC20基因克隆及特性分析

周亮第，姚正培，楊文艷，劉 豪，張振清，王 波，任燕萍，張 樺

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

梭梭(HaloxylonammodendronBunge)是藜科(Chenopodiaceae)梭梭屬(Haloxylon)超旱生植物，它生長在荒漠和半荒漠地區(qū)，具有較強(qiáng)的抗旱、耐極端溫度、耐鹽堿、耐貧瘠等生態(tài)適應(yīng)性[1]，被稱為“沙漠衛(wèi)士”，在防風(fēng)固沙、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、改善小氣候方面具有不可替代的作用[2]。干旱一般被認(rèn)為是影響梭梭幼苗成活的主要因素，而在荒漠極端環(huán)境條件下，導(dǎo)致梭梭自然更新困難的主要因素還有地表高溫對其幼苗和幼株存活的影響。Yu等[3]通過模擬地表高溫脅迫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)地表高溫是影響梭梭幼苗存活的主要原因之一。深入探究梭梭抗逆分子機(jī)制、挖掘相關(guān)抗逆基因?qū)τ诔浞职l(fā)掘梭梭植物資源潛力及提高梭梭種植中的幼苗存活率具有重要意義。NAC轉(zhuǎn)錄因子是陸生植物特有的、成員最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其名稱由均含有NAC結(jié)構(gòu)域的矮牽牛NAM、擬南芥ATAF1/2及CUC基因首字母縮合而成[4]。典型的NAC蛋白N端是一個(gè)高度保守的可結(jié)合DNA的NAC結(jié)構(gòu)域，包含大約150個(gè)氨基酸殘基，構(gòu)成A～E5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，C端是一個(gè)高度可變的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)[5]。近年來，隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6-7]、水稻(Oryzasativa)[8-10]、葡萄(Vitisvinifera)[11]、煙草(Nicotianatabacum)[12]、玉米(Zeamays)[13]，馬鈴薯(Solanumtuberosum)[14]，紫花苜蓿(Medicagotruncatula)[15]，大豆(Glycinemax)[16-17]等多種植物的NAC家族成員得以鑒定。對NAC基因的表達(dá)特性及生物學(xué)功能研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物側(cè)根發(fā)生[18]、細(xì)胞次生壁積累[19]、木質(zhì)部導(dǎo)管形成[20]、細(xì)胞分化控制[21]等生長發(fā)育過程中通過調(diào)節(jié)下游功能基因而行使重要作用。同時(shí)，NAC轉(zhuǎn)錄因子也廣泛參與植物響應(yīng)生物和非生物逆境脅迫，已被證實(shí)NAC轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)干旱、高鹽、低溫、高溫、ABA等非生物脅迫，過表達(dá)NAC基因的轉(zhuǎn)基因植株抗逆性得到提高[5-18,22-23]。轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，NAC基因家族中有約20%～25%的成員至少能響應(yīng)一種脅迫[10，24-25]。由此可見，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)逆境脅迫、提高抗逆性中發(fā)揮重要作用。開展梭梭NAC基因相關(guān)研究對于深入理解梭梭抗逆機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義。

本研究以梭梭為材料，克隆HaNAC20基因，并對其生物信息學(xué)特征、逆境響應(yīng)特性、亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)錄激活活性及轉(zhuǎn)錄激活功能域進(jìn)行分析，為深入探索梭梭抗逆機(jī)制提供依據(jù)，為抗逆基因工程提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

梭梭(HaloxylonammodendronBunge)種子采集于新疆阜康沙漠植物園，室溫自然干燥后保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.2 HaNAC20克隆與生物信息學(xué)分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期梭梭干旱和模擬地表高溫脅迫轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，對含有NAC結(jié)構(gòu)域的序列進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選閾值為Qvalue<0.005且|log2FoldChange|>1，選擇在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中響應(yīng)脅迫上調(diào)表達(dá)的NAC基因Unigene序列開展本研究。以HaNAC20Unigene序列為模板，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物(F：5′-CTTCAACCTTCGTCAATCGT-3′，R：5′-ATCTGACAGGCATTGGGCAT-3′)。提取干旱脅迫后的梭梭總RNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、上下游引物各2.0 μL、cDNA 模板1.0 μL、Taq酶0.5 μL、超純水15 μL，總體積為25 μL。PCR程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。瓊脂糖凝膠(10 g/L)電泳后，用膠回收試劑盒法(全式金公司)回收PCR產(chǎn)物目的條帶，連接pEASY-T1 simple載體(全式金公司)，進(jìn)行 測序。

對HaNAC20基因編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行理化性質(zhì)分析，使用BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行相似序列搜索，使用PROSITE(http://prosite.expasy.org/)進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測，使用cNLS Mapper(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)預(yù)測核定位信號，使用DNAMAN軟件分析測序結(jié)果、識別開放閱讀框序列(ORF)、輸出多序列比對結(jié)果，使用MEGA 5軟件以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析所屬基因亞族。

1.3 HaNAC20基因不同脅迫處理下的表達(dá)量

參照劉豪[26]、宗興風(fēng)等[27]的方法，培養(yǎng)梭梭幼苗，待幼苗根系充分生長、同化枝長度約10 cm時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)處理。分別使用20% PEG6000溶液、200 mmol/L NaCl溶液、20 μmol/L IAA溶液和100 μmol/L ABA溶液處理梭梭幼苗，于處理0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h時(shí)采集梭梭同化枝作為分析基因表達(dá)量材料，液氮速凍后置于 -80 ℃冰箱保存。選取沙土中生長一致的1 a齡梭梭苗進(jìn)行模擬地表高溫脅迫：用電熱帶控溫(專利號：201010283141.0)加熱地表土壤模擬地表高溫脅迫，分別在55 ℃高溫脅迫0 h、2 h、 12 h、24 h時(shí)采集根和同化枝樣品，脅迫24 h后降溫維持在 30 ℃恢復(fù)，并在脅迫后3 d、6 d和 15 d時(shí)繼續(xù)采集根和同化枝樣品，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 GFP融合表達(dá)載體構(gòu)建和亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)HaNAC20CDS序列設(shè)計(jì)引物(F：5′-CCCAGATCTGATGGATGCAAAAAGATGT-TCTAG-3′，R：5′-CGACTAGTAAACTGCTTGTAAGATATGTGTTCC-3′)，使用無縫克隆試劑盒(南京諾唯贊公司)將HaNAC20全長CDS(不含終止密碼子)連接到pCAMBIA1304載體上，構(gòu)建35S::HaNAC20-GFP融合載體并轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞[29]，在激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM 510 SYSTEM)下觀察GFP融合蛋白綠色熒光分布情況。

1.5 酵母單雜交分析轉(zhuǎn)錄激活活性及轉(zhuǎn)錄激活功能域

為分析該轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性及轉(zhuǎn)錄激活功能域，設(shè)計(jì)HaNAC20基因全長編碼區(qū)引物(F：5′-TCAGAGGAGGACCTGCATATGATGATGATGGATGCAAAAAGATGTTC-3′，R：5′-TCGACGGATCCCCGGGAATTCTTACTAAAACTGCTTGTAAGATATGTTCCCA-3′)、N端結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)引物(F：5′-TCAGAGGAGGACCTGCATATGATGATGGATGCAAAAA-GATGTTC-3′，R：5′-TCGACGGATCCCCGGGAATTCCTTCTTGTAAATTCGACATAAT-ACCC-3′)及C端結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)引物(F：5′-TCAGAGGAGGACCTGCATATGAGGCATGTAG-CAAGGACAGA-3′，R：5′-TCGACGGATCCC-CGGGAATTCCTAAAACTGCTTGTAAGAT-ATGTTCC-3′)。使用無縫克隆試劑盒(南京諾唯贊)分別將HaNAC20全長、N端、C端的編碼區(qū)序列插入到酵母表達(dá)載體pGBKT7中，重組轉(zhuǎn)化子分別命名為pGBKT7-F、pGBKT7-N、pGBKT7-C，并轉(zhuǎn)化酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞涂布于全營養(yǎng)型和SD/-Trp一缺培養(yǎng)基上觀察生長情況，再于SD/-Trp/-His/-Ade三缺培養(yǎng)基中，用X-Gal染色分析轉(zhuǎn)錄自激活活性及轉(zhuǎn)錄激活功能域。

2 結(jié)果與分析

2.1 梭梭 HaNAC20基因克隆

以梭梭cDNA為模板，擴(kuò)增得到985 bp的片段(圖1)。目的片段經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序、ORF識別及編碼蛋白翻譯，結(jié)果顯示該序列中包含長度為822 bp(GenBank登錄號：KU845314)的ORF序列，編碼273個(gè)氨基酸的蛋白序列。

2.2 HaNAC20基因的生物信息學(xué)分析

對梭梭HaNAC20基因編碼的273個(gè)氨基酸的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。ProtParam預(yù)測分析表明，該蛋白分子質(zhì)量31.12 ku，含29個(gè)酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)，含33個(gè)堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)，理論等電點(diǎn)8.73，總平均疏水性為-0.703，是一個(gè)親水蛋白。經(jīng)BLAST序列搜索，梭梭HaNAC20基因編碼的蛋白與菠菜NAC蛋白(KNA22936)相似性為87.7%，與藜麥NAC蛋白(XP_021747028)的相似性為84.4%，與甜菜NAC蛋白(KMT07023)的相似性為 82.2%，與擬南芥NAC蛋白(AAM63330)的相似性是61%。多序列比對結(jié)果及功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析表明， HaNAC20蛋白N端有一個(gè)保守的NAC家族特有的結(jié)構(gòu)域(分A、B、C、D、E 5個(gè)區(qū))，而一致性低的C端是轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(圖2-A，圖2-B)，135～167 aa處具有一個(gè)核定位信號區(qū)(圖2-C)，證明HaNAC20具有NAC轉(zhuǎn)錄因子的典型特征，是梭梭NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員。進(jìn)而選取擬南芥、水稻和鷹嘴豆的NAC蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果顯示HaNAC20屬于NAC家族SNAC亞族(圖2-D)。

2.3 不同處理下梭梭 HaNAC20基因的表達(dá) 分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析HaNAC20基因?qū)Ψ巧锬婢臣凹に靥幚淼捻憫?yīng)特性，結(jié)果顯示，干旱、高鹽、高溫、IAA、ABA處理均能不同程度誘導(dǎo)該基因上調(diào)表達(dá)。干旱脅迫后，HaNAC20基因在12 h時(shí)表達(dá)量顯著提高至未脅迫的23倍(圖3-A)。高鹽處理時(shí)，HaNAC20基因在24 h時(shí)表達(dá)量明顯上升至未脅迫的14倍(圖3-B)。模擬地表高溫脅迫時(shí)，同化枝中HaNAC20在55 ℃脅迫處理后3 d達(dá)到最大，后表達(dá)量下降(圖3-C)。而梭梭的根部在55 ℃處理后，HaNAC20在2 h表達(dá)量即達(dá)到最大，后表達(dá)量下降，15 d時(shí)恢復(fù)到脅迫前水平(圖3-D)，表明在地表高溫脅迫初期，該基因主要在根中響應(yīng)，而到脅迫后期在同化枝中響應(yīng)。HaNAC20基因在IAA處理時(shí)表達(dá)量呈先上升后下降趨勢，在 6 h達(dá)到最大，為未脅迫的70倍(圖3-E)；在ABA處理時(shí)表達(dá)量呈逐漸上升趨勢(圖3-F)。

2.4 HaNAC20蛋白的亞細(xì)胞定位分析

在線工具cNLS Mapper預(yù)測顯示 HaNAC20蛋白具有核定位信號，進(jìn)一步采用農(nóng)桿菌侵染法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥上表皮細(xì)胞分析亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，HaNAC20與GFP的融合蛋白定位于細(xì)胞核中，而空載體的GFP蛋白分布于整個(gè)細(xì)胞(圖4)，證明 HaNAC20蛋白在細(xì)胞核內(nèi)行使其功能。

2.5 HaNAC20蛋白轉(zhuǎn)錄激活活性及轉(zhuǎn)錄激活功能域的鑒定

酵母單雜交試驗(yàn)結(jié)果表明，在YPDA全營養(yǎng)型培養(yǎng)基及SD/-Trp一缺培養(yǎng)基上，含重組載體及空載體的酵母轉(zhuǎn)化子均能快速生長(圖5-B)；在SD/-Trp/-His/-Ade三缺培養(yǎng)基上，只有含HaNAC20完整蛋白的pGBKT7-F或含C端的pGBKT7-C重組載體的酵母轉(zhuǎn)化子能夠生長(圖5-C)，并在X-Gal顯色反應(yīng)中呈現(xiàn)藍(lán)色，表明這兩種重組載體中的His和LacZ報(bào)告基因被激活表達(dá)。這些結(jié)果證明 HaNAC20蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活功能域位于蛋白C端的轉(zhuǎn)錄因子。

3 討 論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是陸生植物特有的、成員最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其成員在擬南芥、水稻和其他植物中參與許多調(diào)控和發(fā)育過程[30]。本研究從梭梭中克隆得到HaNAC20基因，生物信息學(xué)預(yù)測及亞細(xì)胞定位試驗(yàn)均表明 HaNAC20蛋白定位于細(xì)胞核中，這與其他已經(jīng)驗(yàn)證過的NAC轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致[31-33]。在過去的研究中，許多NAC家族SNAC亞族成員被鑒定為植物應(yīng)激反應(yīng)中參與復(fù)雜信號傳導(dǎo)過程的重要組成部分，在提高植物應(yīng)對干旱、高鹽、極端溫度等非生物逆境方面發(fā)揮重要作用[22]。本研究中HaNAC20經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析表明其屬于SNAC亞族，顯示其可能參與梭梭響應(yīng)非生物逆境過程。已有研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子家族中部分成員不具有轉(zhuǎn)錄激活活性[34]，通常具有轉(zhuǎn)錄激活活性的NAC蛋白轉(zhuǎn)錄激活功能域位于C端[35]。本研究通過酵母單雜交試驗(yàn)證實(shí)HaNAC20具有轉(zhuǎn)錄激活功能，并且轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域位于C端，表明其具有一般轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，這與SNAC亞族基因調(diào)控下游逆境耐受功能基因或ABA信號通路基因功能相一致。各種逆境脅迫響應(yīng)基因功能不同，其表達(dá)模式存在差異，已有研究顯示NAC基因可響應(yīng)多種逆境脅迫及激素處理，在處理后多呈上調(diào)表達(dá)，但不同成員響應(yīng)模式不盡相同[22，25，27]。本研究中HaNAC20在干旱、高鹽、地表高溫、IAA和ABA多種逆境脅迫誘導(dǎo)后的不同時(shí)間上調(diào)表達(dá)，在干旱、高鹽脅迫12 h后表達(dá)量顯著上升，而在ABA或IAA激素處理1～3 h后表達(dá)量即顯著提高，表明HaNAC20對激素處理更加靈敏，其在梭梭應(yīng)對非生物逆境時(shí)可能作為后程調(diào)節(jié)基因發(fā)揮作用。在模擬地表高溫脅迫試驗(yàn)中，HaNAC20在梭梭根與同化枝中表達(dá)模式明顯不同，同化枝中表達(dá)量直到24 h后才顯著升高，這與黑麥草NAC基因響應(yīng)高溫脅迫模式基本一致[25]；然而，HaNAC20在根中響應(yīng)非常迅速，2 h即大量表達(dá)，隨后逐漸下降，15 d時(shí)基本恢復(fù)正常水平，而同化枝中15 d時(shí)仍顯著上調(diào)表達(dá)，推測一方面是因?yàn)樗笏笊L環(huán)境的沙土能快速將地表高溫傳導(dǎo)至根部誘導(dǎo)基因表達(dá)，另一方面，這種地上地下組織基因表達(dá)模式的時(shí)空差異對梭梭適應(yīng)沙漠高溫環(huán)境具有重要意義。與梭梭中HaNAC2相比[27]，HaNAC20在響應(yīng)高鹽時(shí)，響應(yīng)速度及上調(diào)倍數(shù)均低于HaNAC2，但在響應(yīng)高溫時(shí)，持續(xù)上調(diào)的時(shí)間更長，表明梭梭的這兩個(gè)基因功能上存在側(cè)重，推測HaNAC20在梭梭應(yīng)對高溫脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。

迄今為止，對NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究雖然已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但仍存在薄弱之處：雖然NAC蛋白的功能多樣化，但目前對NAC轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)對逆境的研究主要集中在參與響應(yīng)干旱、高鹽、低溫等脅迫，關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對高溫脅迫中的作用研究相對較少；梭梭因其優(yōu)異的抗逆性，既是典型的野生荒漠植物，也是防風(fēng)固沙的首選立地植物，其NAC轉(zhuǎn)錄因子少有報(bào)道，本研究結(jié)果可從NAC轉(zhuǎn)錄因子這個(gè)側(cè)面為揭示梭梭抗逆的分子機(jī)制提供依據(jù)，為篩選梭梭抗逆材料提供理論指導(dǎo)，也可為植物抗逆基因工程研究提供新的候選基因。

A.重組載體結(jié)構(gòu)圖；B.YPDA全營養(yǎng)型培養(yǎng)基中生長狀況；C.酵母轉(zhuǎn)化子中 HaNAC20蛋白轉(zhuǎn)錄活性分析