金黃色葡萄球菌性奶牛乳房炎調(diào)查及菌株耐藥性和毒力分析

劉肖利，劉璐瑤，李鑌罡，裴文剛，李 斌，程 彪，蘇戰(zhàn)強(qiáng)，李勤凡

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起奶牛乳房炎的主要病原菌，在某些奶牛場(chǎng)感染率達(dá)50%以上[1]，乳房炎不僅損害動(dòng)物健康，同時(shí)給奶產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，影響乳制品品質(zhì)，危及人類健康[2-3]。金黃色葡萄球菌對(duì)常用的抗菌藥物極易產(chǎn)生耐藥性，由其導(dǎo)致的奶牛乳房炎一般很難治愈[4]。金黃色葡萄球菌致病力的強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的各種毒素和侵襲性酶[5-7]，包括α-溶血素(hemolysin-α，hla)、β-溶血素(hemolysin-β，hlb)、腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)、休克綜合-1毒素(toxicshock syndrome toxin-1，tsst-1)、凝集因子A(clumping factor A，clfa)、殺白細(xì)胞素(panton valentine leukocidin，pvl)、纖連蛋白結(jié)合蛋白(fibronectin binding protein，fnBP)、耐熱核酸酶(thermostable nuclease，nuc)等[8-10]。

新疆是中國五大牧區(qū)之一，具有獨(dú)特的養(yǎng)殖地理環(huán)境。奶牛品種主要包括中國荷斯坦奶牛、西門塔爾牛、新疆褐牛及改良的新疆本地品種牛。截止2017年，新疆地區(qū)奶牛的存欄數(shù)已增至269.0萬，年均產(chǎn)奶量增至330.0萬t。但乳房炎的頻發(fā)導(dǎo)致產(chǎn)奶量不斷下降，嚴(yán)重影響本地奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本研究對(duì)新疆烏魯木齊、伊犁、昌吉地區(qū)7個(gè)奶牛場(chǎng)采集的乳房炎樣本進(jìn)行金黃色葡萄球菌的分離鑒定、耐藥性檢測(cè)，同時(shí)利用PCR方法對(duì)分離菌株的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，分析目前新疆部分地區(qū)引起奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌的耐藥情況及毒力因子的流行情況，為牛場(chǎng)奶牛乳房炎防控措施的制定和評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及處理

2019年9月—2020年6月，在新疆烏魯木齊、伊犁、昌吉地區(qū)7個(gè)奶牛場(chǎng)(奶牛場(chǎng)編號(hào)為 A～G)隨機(jī)采集患乳房炎奶牛乳汁樣本15～25份，共采集142頭患乳房炎奶牛的乳汁樣本142份。采集乳樣時(shí)使用溫水將患病奶牛的乳頭清洗干凈后，再用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精棉擦拭消毒乳頭，使用消毒紙巾擦干后，棄去前3把乳汁，用無菌管采集第3把以后的乳汁約50 mL，將樣品分別標(biāo)記后，放入采樣箱中送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.2 主要試劑

革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；腦心浸出液肉湯(Brain Heart Infusion Broth BHI)、Mueller-Hinton瓊脂(MH)、Baird-Parker瓊脂、亞碲酸鹽卵黃增菌液、細(xì)菌微量生化管(過氧化氫酶)、細(xì)菌微量生化管(兔血漿)均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；5%綿羊血平板為自制(百分?jǐn)?shù)表示體積分?jǐn)?shù))；2×TaqPCR Master Mix、ddH2O均購自生工生物(上海)股份有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；16種葡萄球菌屬生化鑒定管、13種常用抗菌藥物(氧氟沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、慶大霉素、頭孢唑啉、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、克林霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素)均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器

普通光學(xué)顯微鏡購自Nikon公司；凈化工作臺(tái)(型號(hào)：SW-CJ-2FD)購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DYY-7C型電泳儀購自北京市六一儀器廠；PCR擴(kuò)增儀購自Eppendorf公司；電熱恒威培養(yǎng)箱(型號(hào)：DHP-9082B)購自上海恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫振蕩器(型號(hào)：TS-2102C)購自山海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；高溫高壓滅菌鍋(型號(hào)：HVE-50)購自日本Hirayayama制造公司；凝膠成像分析系統(tǒng)(TRANSILLUMINATOR JVLABO)。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

60只健康昆明系小白鼠，雌雄各半，體質(zhì)量20～25 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.5 金黃色葡萄球菌分離鑒定

1.5.1 金黃色葡萄球菌的初篩 將采集的乳汁樣本加入BHI液體培養(yǎng)基，于搖床37 ℃增菌培養(yǎng)18～24 h后，無菌操作涂布于5%綿羊血平板和Baird-Parker瓊脂平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后，挑取疑似金黃色葡萄球菌的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，并接種于LB瓊脂進(jìn)行純化培養(yǎng)，-20 ℃保存。

1.5.2 生化鑒定 接觸酶試驗(yàn)：在載玻片上滴加1～2滴體積分?jǐn)?shù)3% H2O2，挑取疑似金黃色葡萄球菌的單菌落與H2O2充分混合后，觀察有無氣泡產(chǎn)生，如有氣泡產(chǎn)生則判定為陽性，無氣泡產(chǎn)生則判定為陰性[11]。血漿凝固酶試驗(yàn)：取20 μL BHI培養(yǎng)物加入有血漿凝固酶的安瓿瓶中，充分混勻后放入恒溫箱37 ℃培養(yǎng)，每隔30 min觀察1次，連續(xù)觀察6 h，如出現(xiàn)凝固或者大量凝塊則判定為陽性；并設(shè)生理鹽水陰性對(duì)照[12]。將純化后的金黃色葡萄球菌疑似菌株增菌培養(yǎng)后進(jìn)行生化鑒定，鑒定方法及結(jié)果判定按葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)(TH-16S)進(jìn)行。

1.5.3 分離菌株16S rDNA序列擴(kuò)增 (1)基因組DNA的提?。翰捎盟蠓ㄌ崛》蛛x菌株的基因組DNA。分離菌株37 ℃震蕩培養(yǎng)18～ 24 h，12 000 r/min離心菌液3 min，棄上清，使用生理鹽水反復(fù)沖洗2次，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心3 min，取上清，-20 ℃保存，備用。

(2)PCR鑒定：使用參考文獻(xiàn)[13]報(bào)道的細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表1)。50 μL反應(yīng)體系包括2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，提取的分離菌株基因組DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL；反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；然后取6 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳液中電泳，電壓120 V，電泳時(shí)間30 min，經(jīng)紫外凝膠成像后統(tǒng)計(jì)結(jié)果；并將有明亮條帶的對(duì)應(yīng)PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.6 分離菌株耐藥性檢測(cè)

采用K-B紙片擴(kuò)散法選取13種常用的藥敏紙片(氧氟沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、慶大霉素、頭孢唑啉、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、克林霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；從Baird-Parker瓊脂平板上挑取單菌落接種于BHI肉湯過夜增菌培養(yǎng)后，將菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，?00 μL均勻涂布于MH培養(yǎng)基上，13種抗菌藥物紙片分別貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)8～12 h，測(cè)量抑菌圈直徑。藥敏試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)( NCCLS) 制定的標(biāo)準(zhǔn)判定[14]。

1.7 分離菌株毒力基因檢測(cè)

根據(jù)參考文獻(xiàn)[15-16]中報(bào)道的引物序列，合成金黃色葡萄球菌毒力基因nuc、pvl、fnbA、fnbB、hla、hlb、sea、seb、eta、etb、tsst-1、clfA共12對(duì)特異性引物，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。12種毒力基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系相同，反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。nuc基因的PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。pvl、fnbA、fnbB、hla、hlb、sea、seb、eta、etb、tsst-1、clfA基因的PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)紫外凝膠成像后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.8 小鼠攻毒試驗(yàn)

60只健康昆明系小白鼠隨機(jī)分為6組，5個(gè)試驗(yàn)組命名為A～E組，另設(shè)1組為對(duì)照組。將分離菌株分別接種于BHI肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃搖床增菌18～24 h；用生理鹽水將菌液稀釋至 1×108CFU/mL，試驗(yàn)前小鼠禁食禁水12 h，試驗(yàn)組小鼠分別腹腔注射分離菌株肉湯培養(yǎng)物 0.5 mL，對(duì)照組小鼠注射等量生理鹽水，觀察24～ 48 h內(nèi)小鼠精神狀態(tài)、食欲、發(fā)病和死亡情況等。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌分離鑒定結(jié)果

從7個(gè)奶牛場(chǎng)采集的142份患乳房炎奶牛乳汁樣本中共分離出5株疑似金黃色葡萄球菌，其中昌吉地區(qū)B牛場(chǎng)分離到2株，分離率為7.14%(2/28)，烏魯木齊地區(qū)G牛場(chǎng)中分離到3株，分離率為8.82%(3/34)；其余5個(gè)奶牛場(chǎng)的樣本中均未檢出。疑似菌株在5%綿羊血平板上形成表面光滑、濕潤、隆起的灰白色圓形菌落，呈 β 溶血(圖1)；在Baird-Parker瓊脂平板上形成的菌落為黑色，周圍有灰白色渾濁帶，最外圍有透明環(huán)(圖2)。鏡檢結(jié)果顯示，分離菌株均為革蘭氏陽性球菌，以單個(gè)、成對(duì)或葡萄狀存在(圖3)。

分離菌株接觸酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)結(jié)果全為陽性；根據(jù)表2結(jié)果，結(jié)合葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)(TH-16S)，初步確定5株分離菌株均為金黃色葡萄球菌。

表2 疑似分離菌株生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of biochemical test of suspected isolates

以5株分離菌基因組DNA為模板，以通用引物采用PCR方法擴(kuò)增其16S rDNA基因片段，在1 500 bp處出現(xiàn)明亮條帶(圖4)，長(zhǎng)度與預(yù)期目的片段大小相符。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析比對(duì)，顯示5株分離菌株與金黃色葡萄球菌的同源性均達(dá)99 %，結(jié)合生化試驗(yàn)結(jié)果，確定分離菌株均為金黃色葡萄球菌。

2.2 分離菌株耐藥性檢測(cè)結(jié)果

使用9大類13種抗菌藥物對(duì)5株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，5株金黃色葡萄球菌分離株最少耐1種抗生素，最多耐5種抗生素(圖5)；對(duì)青霉素類中的青霉素G和β-內(nèi)酰胺類中的氨芐西林耐藥率均高達(dá)80%；對(duì)鏈霉素、頭孢他啶和阿莫西林的耐藥率較高，耐藥率均為60%；對(duì)紅霉素的耐藥率為20%；對(duì)氧氟沙星、慶大霉素、頭孢唑啉、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、克林霉素、環(huán)丙沙星全部敏感(圖6)。

2.3 金黃色葡萄球菌分離株毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果

對(duì)5株奶牛源乳房炎金黃色葡萄球菌分離株的毒力基因進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，12種毒力基因中檢出nuc、clfa、eta、sea、fnbB5種，目的條帶大小分別為400 bp、292 bp、676 bp、560 bp、524 bp；pvl、fnbA、hla、hlb、seb、etb、tsst-1基因未檢測(cè)出(圖7)。

所有分離的金黃色葡萄球菌菌株均含有2種以上的毒力基因，檢出率分別是nuc(100%)、clfa(100%)、fnbB(60%)、sea(20%)、eta(20%)(圖 8)；從分離的金黃色葡萄球菌菌株中檢出的5個(gè)毒力基因共有3種毒力基因組合(圖 9)，其中nuc、clfa基因組合在B牛場(chǎng)被檢菌株中較為流行，nuc、clfa、fnbB基因組合在G牛場(chǎng)被檢菌株中較為流行。

2.4 小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果

小鼠腹腔注射攻毒菌液8～12 h后，小鼠均出現(xiàn)精神沉郁、全身發(fā)抖、喜臥等癥狀，試驗(yàn)組小鼠24～48 h內(nèi)均出現(xiàn)死亡，A組死亡10只，B組、C組、D組均死亡8只，E組死亡6只，死亡率分別為100%、80%、80%、80%、60%；解剖死亡小鼠可見肝腫大，脾、腎有出血點(diǎn)，從死亡小鼠的肝脾等器官中能分離到接種的金黃色葡萄球菌；對(duì)照組小鼠正常。

3 討 論

奶牛乳房炎是全球范圍內(nèi)危害奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的一種重要疾病，嚴(yán)重影響著各國乳制品行業(yè)的發(fā)展。金黃葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一。本研究從142份患乳房炎奶牛乳汁樣本中共分離出5株金黃色葡萄球菌，7個(gè)奶牛場(chǎng)有2個(gè)牛場(chǎng)檢出并分離到金黃色葡萄球菌，分離率分別為7.14%(2/28)和8.82%(3/34)。Normanno等[17]報(bào)道的意大利牛奶、乳制品、肉類、肉制品等動(dòng)物源性食品樣本中金黃色葡萄球菌的分離率為9.79%，張行等[18]報(bào)道的中國奶牛養(yǎng)殖區(qū)乳房炎金黃色葡萄球菌的分離率為 8.75%；鄒佳琪等[19]報(bào)道的南寧地區(qū)某奶牛場(chǎng)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的分離率為6.8%，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。在王帥等[20]的研究中，北疆地區(qū)奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌的分離率為50%；歐都等[21]報(bào)道的新疆石河子地區(qū)奶牛隱性乳房炎源金黃色葡萄球菌的分離率為44.71%，均高于本試驗(yàn)結(jié)果。造成金黃色葡萄球菌分離率的差異性可能與不同奶牛場(chǎng)流行菌種有關(guān)。

近年來，奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌耐藥菌株數(shù)呈不斷增加的趨勢(shì)，其耐藥性也不斷增強(qiáng)。本研究對(duì)5株奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌分離株進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，分離株對(duì)氧氟沙星、慶大霉素、頭孢唑啉、四環(huán)素、復(fù)方新諾明等多數(shù)抗菌藥物敏感，由于不同場(chǎng)區(qū)分離的菌株耐藥性有所差異，本研究結(jié)果只能為菌株來源場(chǎng)治療乳房炎藥物選擇提供參考；分離株對(duì)青霉素G、氨芐西林、鏈霉素、頭孢他啶、紅霉素、阿莫西林的耐藥率為20%～80%，其中對(duì)青霉素G和氨芐西林耐藥率最高為80%。多項(xiàng)研究報(bào)道[22-24]，北疆地區(qū)奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素類、β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率均高于本試驗(yàn)結(jié)果。耐藥性結(jié)果表明，目前新疆部分地區(qū)奶牛場(chǎng)乳房炎金黃色葡萄球菌耐藥性不強(qiáng)，不同奶牛場(chǎng)金黃色葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的敏感程度可能與奶牛場(chǎng)使用抗生素習(xí)慣不同有關(guān)。

金黃色葡萄球菌的致病性與其攜帶的毒力基因有關(guān)。本研究通過PCR方法對(duì)5株金黃色葡萄球菌分離株的12種常見毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)出nuc、clfa、fnbB、sea、eta5種毒力基因，其余毒力基因均未檢出。Salasia等[25]報(bào)道牛乳房炎源金黃色葡萄球菌的毒力基因檢測(cè)結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致，均為nuc、fnbA、hla較高。Sharma等[26]報(bào)道的牛乳源金黃色葡萄球菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果與本研究結(jié)果不完全一致，其中fnbB基因檢出率高于本研究結(jié)果，而clfa、sea基因檢出率遠(yuǎn)低于本研究結(jié)果。王新等[27]報(bào)道的陜西地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌pvl毒力基因檢出率較高，seb、sed、sea、sej基因檢出率較低，與本結(jié)果有差異。在楊波等[28]的研究中，新疆烏魯木齊周邊奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌主要攜帶nuc、clfa、fnbA和hla基因，而在本研究中，nuc、clfa和fnbB基因的檢出率較高，說明fnbB基因可能是新疆地區(qū)新增的流行毒力基因。在不同地區(qū)引起奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌攜帶的毒力基因分布有所區(qū)別，可能存在地域性差異。小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究分離的金黃色葡萄球菌均具有較強(qiáng)的致病性，這可能是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要原因，且菌株具有一定程度的耐 藥性。

4 結(jié) 論

新疆部分地區(qū)由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染情況較為嚴(yán)重，分離菌株具有一定的耐藥性，攜帶多個(gè)毒力基因且致病性較強(qiáng)。