不同劑量早期腸內(nèi)營養(yǎng)對腸缺血再灌注損傷大鼠骨骼肌高分解代謝的影響

唐少秋，程旻樺，段劍鋒，高 濤

0 引 言

高分解代謝在重癥患者中普遍存在，會(huì)導(dǎo)致骨骼肌消耗增加，進(jìn)而引起獲得性衰弱、住院時(shí)間延長和生活質(zhì)量下降[1-2]。但目前對骨骼肌高分解代謝尚無有效的治療措施。合理的營養(yǎng)支持策略有助于緩解骨骼肌消耗[3]。與腸外營養(yǎng)(parenteral nutrition, PN)相比，腸內(nèi)營養(yǎng)(enteral nutrition，EN)能改善骨骼肌力量[4].有研究表明，不同的早期腸內(nèi)營養(yǎng)(early enteral nutrition，EEN)途徑對膿毒癥導(dǎo)致的骨骼肌高分解代謝影響不同，并考慮這種差異與EEN對胃腸道內(nèi)分泌功能的作用有關(guān)[5]。

研究表明，20%、40%、60%的EEN均能緩解腸缺血再灌注損傷(Ischemia-Reperfusion, I/R)后的小腸炎癥反應(yīng)[6]。但急性胃腸功能損傷在重癥患者中普遍存在[7]，不同劑量EEN對急性胃腸功能障礙患者的影響不同，不恰當(dāng)?shù)腅N喂養(yǎng)方案會(huì)增加喂養(yǎng)不耐受發(fā)生率[8-9]，而一旦發(fā)生喂養(yǎng)不耐受，會(huì)影響患者預(yù)后[10]。EN喂養(yǎng)劑量與喂養(yǎng)不耐受發(fā)生率密切相關(guān)。由此推測，明確EN最佳劑量，既能避免喂養(yǎng)不耐受對機(jī)體的影響，又能發(fā)揮對腸道的調(diào)節(jié)作用，這對調(diào)節(jié)骨骼肌高分解代謝有重要意義。因此，本研究擬通過觀察不同劑量EEN對急性骨骼肌高分解代謝的影響，為更好的應(yīng)對急性骨骼肌消耗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑健康成年雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，動(dòng)物許可證號：SCXK(滬)2018-0006?？漳c造口管及中心靜脈留置管購自美國Helix醫(yī)療公司；腸內(nèi)營養(yǎng)(安素)購自雅培公司；腸外營養(yǎng)組分購自華瑞公司；MuRF-1抗體、MAFbx購自英國ABCAM；cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒購自上海凡科維。給予大鼠12 h晝夜交替光照，術(shù)前12 h禁食水，術(shù)后禁食，自由飲水。

1.2方法

1.2.1 腸缺血再灌注損傷模型腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，于劍突下方做正中切口(約3 cm)，輕柔翻動(dòng)腸管暴露根部，仔細(xì)尋找并分離腸系膜上動(dòng)脈，用無創(chuàng)微血管夾閉血管根部，觀察小腸色澤由紅潤轉(zhuǎn)為蒼白色且腸管周圍小動(dòng)脈搏動(dòng)消失，表明缺血成功。將翻出腸管回納，30 min后松開動(dòng)脈夾，見小腸由蒼白轉(zhuǎn)為暗紅及周圍小動(dòng)脈明顯搏動(dòng)，表明再灌注成功[6]。

1.2.2營養(yǎng)路徑的建立經(jīng)右側(cè)頸內(nèi)靜脈建立腸外營養(yǎng)路徑。在大鼠右側(cè)頸部鎖骨上做1.5 cm 大小縱行切口，分離并暴露右頸外靜脈，輕柔剝離血管周圍結(jié)締組織，用顯微外科剪斜行剪開血管前壁約 0.5 mm，由此置入無菌硅膠管約2 cm，結(jié)扎血管切口遠(yuǎn)心端，切口近端血管與硅膠管固定。置管末端經(jīng)皮下于大鼠尾部中段穿出?；爻橐娀匮C實(shí)置管成功，肝素稀釋液封管備用?？p合頸部切口[6]。

經(jīng)胃造口空腸置管建立EN路徑。由左上腹將遠(yuǎn)端胃輕拉出，于前壁無血管處縫荷包備用，剪開荷包中間胃前壁約 0.5 cm，由此置入硅膠管，緩慢通過胃幽門部，放至幽門遠(yuǎn)端約4 cm，拉攏荷包打結(jié)，將胃輕柔回放至左上腹，牽拉造口管無滑動(dòng)。由左上腹皮下做一約0.5 cm 切口，由此穿出造口管體外端，并再次行造口管固定。由皮下造隧道使置管末端于大鼠大鼠尾部中段穿出。體外段輕推空氣無阻力，證實(shí)置管成功，接肝素帽備用[6]。

1.2.3營養(yǎng)支持方案EN干預(yù)大鼠給予腸內(nèi)營養(yǎng)粉，溶于無菌注射用水(12.5 g 加水配置 50 mL)。PN干預(yù)大鼠按照 EN 成分配置營養(yǎng)液，按照等氮等熱卡配置。所有大鼠均給予全熱卡的60%作為營養(yǎng)支持總量，全熱卡量參考Wu等[6]的研究(200 kcal/kg)。營養(yǎng)支持于造模后第2天啟動(dòng)。將32只大鼠分為60%PN組、20%EN+40%PN組、40%EN+20%PN組和60%EN組，每組8只大鼠。60%PN組大鼠全部由PN途徑給予；20%EN+40%PN組大鼠全熱卡總量的20%由EN途徑給予，40%由PN途徑給予；40%EN+20%PN組大鼠全熱卡總量的40%由EN途徑給予，20%由PN途徑給予；60%EN組大鼠全部由EN途徑給予。

1.2.4組織標(biāo)本獲取與保存所有大鼠均在營養(yǎng)支持72h后處死，用超量的2%戊巴比妥鈉(0.5 mL/100 g)麻醉大鼠，先從心尖部取血2 mL待用，后用等滲鹽水經(jīng)心臟灌注(200 mL)。留取趾長伸肌稱重，并保存至-80 ℃冰箱待測。

1.2.5骨骼肌代謝產(chǎn)物、萎縮蛋白水平及血炎癥因子水平檢測骨骼肌代謝代謝產(chǎn)物測定：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)合法檢測大鼠趾長伸肌3-甲基組氨酸(3-methylhistidine，3-MH)及酪氨酸水平。解凍趾長伸肌，稱取樣本約0.2 g，加入預(yù)冷30%乙醇，振蕩研磨后離心，取離心液上清。用標(biāo)準(zhǔn)品獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，取樣本液上機(jī)檢測，記錄樣本峰濃度下面積，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取3-MH及酪氨酸數(shù)據(jù)。采用免疫印跡檢測趾長伸肌萎縮蛋白肌環(huán)指蛋白-1(muscle ring finger-1，MuRF-1)和肌萎縮蛋白F-box(muscle atrophy F-box，MAFbx)的表達(dá)。取趾長伸肌研磨、裂解，通過SDS /PAGE 分離，并用Western blot分析。酶聯(lián)免疫吸附法測定血IL-1β和TNF-α水平。

2 結(jié) 果

2.1 不同營養(yǎng)支持方案大鼠體重及趾長伸肌的改變同基礎(chǔ)體重[(269.0±7.8)g]比較，所有大鼠在處死時(shí)體重顯著下降[(227.9±10.8)g，P<0.001]。20%EN+40%PN組、40%EN+20%PN組體重改變程度較60%PN組、60%EN組顯著減輕(P<0.05)，趾長伸肌/體重比顯著增高(P<0.05)。見表1。

表1 不同營養(yǎng)方案對大鼠體重及趾長伸肌影響

2.2不同營養(yǎng)支持方案大鼠骨骼肌代謝產(chǎn)物及萎縮蛋白水平的改變與60%PN組比較，20%EN+40%PN組、40%EN+20%PN組大鼠3-MH及酪氨酸水平顯著降低(P<0.05)。與60%EN組比較，20%EN+40%PN組、40%EN+20%PN組大鼠MuRF-1水平水平顯著降低(P<0.05)，20%EN+40%PN組大鼠MAFbx水平顯著降低(P<0.05)。見表2，圖1。

圖1 不同早期腸內(nèi)營養(yǎng)方案對大鼠骨骼肌MURF-1和MAFbx的影響

表2 不同早期腸內(nèi)營養(yǎng)方案對大鼠骨骼肌代謝產(chǎn)物及萎縮蛋白水平的影響

2.3不同營養(yǎng)支持方案大鼠血炎癥因子水平的改變與60%PN組、60%EN組TNF-α、IL-1β水平比較，20%EN+40%PN組、40%EN+20%PN組顯著降低(P<0.01)。見圖2。

*P<0.01

3 討 論

骨骼肌消耗是重癥患者急性期特征性改變之一，并影響患者預(yù)后。既往研究表明，腸內(nèi)營養(yǎng)對骨骼肌消耗有調(diào)節(jié)作用[5]，在本研究中，探討了早期腸內(nèi)營養(yǎng)不同劑量對急性骨骼肌消耗的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其它腸內(nèi)營養(yǎng)劑量相比，20%EN+40%PN能改善腸I/R損傷導(dǎo)致的急性骨骼肌消耗。

已有研究表明，腸內(nèi)營養(yǎng)可以維持腸上皮結(jié)構(gòu)和功能完整、刺激腸蠕動(dòng)、維持腸道內(nèi)正常菌群、促進(jìn) IgA 釋放等[11]。20%熱卡需求量的早期腸內(nèi)營養(yǎng)即能減輕腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，發(fā)揮對腸上皮的保護(hù)作用[6]。急性骨骼肌消耗受炎癥水平影響[12-13]，本研究前期發(fā)現(xiàn)，早期腸內(nèi)營養(yǎng)能減少重癥患者炎癥因子水平[14]，而在本研究中發(fā)現(xiàn)，給予EN后大鼠血TNF-α、IL1-β水平會(huì)明顯降低。因此推測，對全身炎癥的改善可能是EN改善急性骨骼消耗的原因之一。

本研究結(jié)果與既往研究存在相似之處。Wu等研究發(fā)現(xiàn)[6]，給予20%EN、 40%EN、60%EN均能顯著降低腸I/R大鼠腸NF-κB、HIF-1α水平。本研究發(fā)現(xiàn)與60%PN相比，20%EN+40%PN、 40%EN+20%PN能顯著降低大鼠血TNF-α、IL1-β水平；但也發(fā)現(xiàn)與60%EN相比，20%EN+40%PN、 40%EN+20%PN大鼠血TNF-α、IL1-β水平也顯著降低。目前尚不清楚出現(xiàn)這一改變的原因，在Wu等[6]研究中發(fā)現(xiàn)，同20%EN相比，給予40%EN后腸屏障通透性稍有增加，因此推測在腸I/R損傷后，由于急性腸道損傷的存在，機(jī)體對EN的耐受程度有個(gè)“閾值”，一旦EN的量超過這個(gè)閾值，會(huì)對腸道通透性、全身炎癥反應(yīng)有促進(jìn)作用，而這一作用并不同于對腸壁的修復(fù)作用。

既往研究表明，EN+PN的營養(yǎng)方式有助于改善放射性腸損傷患者機(jī)體營養(yǎng)狀況[15]。而本研究發(fā)現(xiàn)，即使均采用EN+PN的營養(yǎng)方式，20%EN+40%PN和40%EN+20%PN對急性骨骼肌消耗的影響也不盡相同。與20%EN+40%PN大鼠相比，40%EN+20%PN大鼠血TNF-α、IL1-β水平差異不明顯，但骨骼肌消耗指標(biāo)及體重降低程度卻略高于20%EN+40%PN大鼠，我們推測與急性腸功能損傷有關(guān)。在本研究中，采用小腸I/R模型，該模型造成腸損傷和高分解代謝狀態(tài)，這勢必會(huì)影響小腸吸收功能，進(jìn)而減少經(jīng)腸道營養(yǎng)素的攝取。相比20%EN+40%PN大鼠有40%能量直接由PN供給，雖然40%EN+20%PN大鼠有40%能量由EN供給，但實(shí)際吸收的能量可能不足40%，這可能會(huì)造成后者骨骼肌消耗水平高于前者。

本研究方案與既往研究也存在不同之處。首先是目標(biāo)能量的設(shè)定，根據(jù)以往研究，腸I/R大鼠日需能量約200 kcal/d[6]。已有研究也表明，對重癥患者允許性低熱卡喂養(yǎng)有利于患者預(yù)后[16-18]。因此，我們認(rèn)為早期全熱卡喂養(yǎng)對腸I/R損傷大鼠并不合理。基于指南中急性疾病早期應(yīng)給予不超過70%全熱卡量的營養(yǎng)支持的建議[19]，以及研究表明低于50%全熱卡量的營養(yǎng)支持會(huì)導(dǎo)致機(jī)體瘦肉質(zhì)減少及感染發(fā)生率增加[20-21]，本研究設(shè)定60%全熱卡為允許性低熱卡喂養(yǎng)劑量，但這個(gè)目標(biāo)量是否符合大鼠急性應(yīng)激期的需要并不明確，如果該目標(biāo)劑量高于實(shí)際需要量，會(huì)造成機(jī)體代謝負(fù)擔(dān)和代謝率增加，而如果該目標(biāo)劑量低于實(shí)際需要量，又會(huì)由于營養(yǎng)供給不足導(dǎo)致骨骼肌分解增加。其次，本研究采用了早期PN營養(yǎng)支持，目的是在腸內(nèi)營養(yǎng)劑量不同時(shí)總能量供給相同，以減少總能量不同對骨骼肌分解代謝的影響。但在2018年歐洲腸外腸內(nèi)營養(yǎng)學(xué)會(huì)在指南中建議，只有當(dāng)存在 EN喂養(yǎng)禁忌證時(shí)，才在3～7 d內(nèi)啟動(dòng)PN[19]。然而，NUTRIREA-2研究觀察了EN和PN對需要有創(chuàng)機(jī)械通氣和血管加壓支持的休克患者的影響，結(jié)果表明兩組之間的感染率和28 d死亡率沒有顯著差異，而接受EN的患者發(fā)生腸缺血的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[8]。Doig等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，對于存在EN禁忌癥的患者，入ICU 24 h內(nèi)給予PN不增加患者死亡率、感染發(fā)生率，也不降低生存質(zhì)量。在CALORIES研究中，重癥患者入ICU后36 h內(nèi)接受經(jīng)EN或PN途徑給予20 kcal/kg/day的營養(yǎng)支持，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30 d死亡率無顯著差異[23]。在本研究中，由于采用的是腸I/R損傷模型，并設(shè)定的是60%的低熱卡喂養(yǎng)，因此才給予早期PN的營養(yǎng)支持方案。但需要注意的是，60%PN組大鼠骨骼肌分解代謝明顯高于20%EN+40%PN組大鼠，這說明即使給予60%的總熱量，僅通過早期PN途徑對機(jī)體也是不利的。

本研究存在一定的局限性。第一是動(dòng)物模型的選擇。管飼腸內(nèi)營養(yǎng)需要通過胃腸道發(fā)揮對機(jī)體的營養(yǎng)供給、代謝調(diào)節(jié)等作用，為保持模型腸功能的一致性，本研究采用腸I/R損傷模型。但需要注意的是，該模型造成的急性胃腸功能損傷程度較重，對腸內(nèi)營養(yǎng)的耐受性較差，會(huì)影響腸內(nèi)營養(yǎng)對骨骼肌分解的作用，因此，在該模型得出的結(jié)論需要在其它模型進(jìn)行驗(yàn)證。第二是EEN影響骨骼肌高分解代謝的機(jī)制仍不明確。本研究雖然發(fā)現(xiàn)發(fā)揮作用可能與全身炎癥反應(yīng)相關(guān)，但是否存在其他的途徑并不清楚，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，對于明確腸I/R損傷導(dǎo)致的急性骨骼肌消耗，不同劑量EEN的影響不同，其中，20%EN+40%PN的改善作用優(yōu)于其它劑量的腸內(nèi)營養(yǎng)。對于其它病因?qū)е碌募毙怨趋兰∠?，EN最適合劑量仍需要進(jìn)一步研究。