兒咳靈糖漿對支氣管哮喘模型小鼠Caspase-3，TNF-α表達(dá)的影響

鄒 月,趙海南，劉丹丹，劉澤林，王 偉，姜星屹

（1廊坊市人民醫(yī)院藥學(xué)部；2北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院；廊坊市人民醫(yī)院3全醫(yī)學(xué)科，4感染科，河北 廊坊 065000）

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的一種常見慢性氣道炎癥，目前全球約有3億支氣管哮喘患者，我國支氣管患者約3千萬，隨著全球工業(yè)化的高速發(fā)展，支氣管哮喘的發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的因素之一[1]。支氣管哮喘病因復(fù)雜，可分為致病因素和誘發(fā)因素兩大類[2]。臨床上有多種治療支氣管哮喘的藥物，如糖皮質(zhì)激素類藥物、β2受體激動劑、茶堿類等，但這些藥物多具有毒副作用[3]。氧化應(yīng)激是患者術(shù)后出現(xiàn)的不良反應(yīng)，在治療過程可介導(dǎo)多種炎癥因子表達(dá)升高，加重疾病導(dǎo)致肺部纖維化[4]。TNF-α（腫瘤壞死因子-α）具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用，由巨噬細(xì)胞等分泌，過表達(dá)的TNF-α可引起惡病質(zhì)，TNF-α還具有促進(jìn)炎癥因子發(fā)展的作用，在機體受到損傷時，增加機體炎癥水平[5]。caspase-3是一種蛋白酶，與細(xì)胞凋亡相關(guān)，caspase-3表達(dá)活性能夠改變細(xì)胞生物學(xué)行為，當(dāng)外源性調(diào)節(jié)caspase-3活性時具有激活細(xì)胞凋亡信號通路能夠分泌大量炎癥因子，造成嚴(yán)重炎癥反應(yīng)[6]。兒咳靈糖漿是連云港市中醫(yī)院院內(nèi)制劑(批準(zhǔn)文號：蘇藥制字Z04000017)，由15味中藥材配伍制成，具有清肺化痰、止咳平喘功效。本研究采用支氣管哮喘模型小鼠，探究兒咳靈糖漿對支氣管哮喘的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器圖像采集及圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；吸入霧化器（德國Pari公司）；酶標(biāo)分析儀（上海信裕生物科技有限公司）；高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；FlexiWash全自動蛋白質(zhì)免疫印跡系統(tǒng)（上海環(huán)亞生物科技有限公司）。

1.2 試藥兒咳靈糖漿是連云港市中醫(yī)院院內(nèi)制劑(批準(zhǔn)文號:蘇藥制字Z04000017)。蘇木素-伊紅試劑盒（上海吉至生化科技有限公司，AG1120）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物科技有限 公 司，EK1578）；Caspase-3抗體（美 國PLlab，PL0403200）；TNF-α抗體（美國PLlab，PL0403040）；山羊抗兔IgG二抗（英國Abcam，ab150077）；DAB染色劑及稀釋液（上海碧云天生物科技有限公司，P0203），其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物50只健康SPF級Sprague-Dawley小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，6～8周齡雌雄參半，體質(zhì)量（275±25）g，溫度22℃，相對濕度50%～65%，自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

2 方法

2.1 動物模型構(gòu)建及分組建模方法：稱取0.1 g OVA和2 g Al（OH）3置于100mL生理鹽水中配成致敏液，于第1天給小鼠腹腔注射1 mL致敏液、第8天再注射1 mL致敏液重復(fù)致敏，14 d后用含2%OVA的生理鹽水超聲霧化器對小鼠進(jìn)行每天噴射激發(fā)，到第22天開始隔天激發(fā)，每次噴射時間為30 min，3次/周持續(xù)激發(fā)6周后，小鼠如出現(xiàn)咳嗽、呼吸加速等癥狀視為建模成功。將建模成功的小鼠分為5組，分別為正常對照組、模型組、兒咳靈糖漿高（0.5 mL/kg）、低（0.1 mL/kg）劑量組、地塞米松組（0.01 mL/kg）。兒咳靈糖漿高、低劑量組分別以0.5 mL/kg和0.1 mL/kg的兒咳靈糖漿灌胃，地塞米松組以0.01 mL/kg地塞米松灌胃，對照組小鼠灌胃同體積的0.9%氯化鈉溶液，每天1次，共8周。末次灌胃后，1%戊巴比妥鈉麻醉后麻醉，甲醛心臟灌注，頸部脫臼安樂死后取肺，甲醛固定后，切成4 mm肺組織片備用。

2.2 肺組織HE染色和天狼星紅染色觀察取各組小鼠肺組織用4%多聚甲醛固定24 h后常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度大約為5～6μm，用蘇木素染液進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片后，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。染色液染色60 min，蒸餾水洗去浮色，中性樹膠封片,顯微鏡下觀察病理變化。

2.3 ELISA檢測血清炎癥因子蛋白表達(dá)各組小鼠取血3 mL，3 500～4 000 r/mim離心10 min，分離得到血清。按ELISA試劑盒說明書操作測定血清中IFNγ、IL-12、IL-6和TNF-α表達(dá)水平。

2.4 western-blot檢測組織中蛋白表達(dá)取各組小鼠肺組織加入0.125%胰蛋白裂解液，剪碎研磨，低速離心機運轉(zhuǎn)4 000 r/min離心10 min，取得上清液，血清樣品中加入樣孔。進(jìn)行電泳，PVDF膜TBS浸泡10min，反復(fù)用PBS緩沖液沖洗，5 min/次，分別加入1抗，GAPDH抗體(1∶500)、過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶2 000），分別雜交，PBS沖洗，后將膜浸入ECL工作液，檢測Caspase-3和TNF-α蛋白濃度，獲取圖象。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肺組織HE染色結(jié)果與正常對照組相比，模型組細(xì)支氣管管腔、肺泡腔內(nèi)可見滲出液、脫落的上皮細(xì)胞等，遠(yuǎn)端肺泡可見局部肺不張及周圍肺大泡，且肺間質(zhì)明顯增厚，炎細(xì)胞浸潤明顯，而與模型組組比較，其余組別癥狀明顯減少，部分肺間質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)趨向正常，部分肺泡輕度擴張，見圖1。

圖1 小鼠肺組織HE染色圖

3.2 小鼠肺組織天狼星紅染色觀察正常對照組無纖維化現(xiàn)象，模型組肺部發(fā)生纖維化，發(fā)現(xiàn)支氣管附近有大量炎癥，肺泡發(fā)生損傷，其余組與之相比肺泡損傷較小，未出現(xiàn)膨脹。經(jīng)過8周的藥物干預(yù)，高劑量組纖維化已基本恢復(fù)至正常，見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織天狼星紅染色

3.3 各組小鼠肺組織平滑肌和支氣管壁厚度比較與正常對照組相比，模型組支氣管厚度和平滑肌厚度均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，低劑量組和高劑量組支氣管厚度和平滑肌厚度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。地塞米松組和高劑量組的支氣管厚度、平滑肌厚度比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），見表1。

表1 各組小鼠支氣管壁和平滑肌增厚情況

3.4 小鼠血清中IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較與正常對照組相比，模型組小鼠血清中IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。相比與模型組，低劑量組和高劑量組血清IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。地塞米松組和高劑量組上述指標(biāo)比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），見表2。

表2 各組小鼠血清中IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較/（pg/mL）

3.5 小鼠肺組織中Caspase-3、TNF-a蛋白表達(dá)與正常對照組相比，模型組肺組織中Caspase-3、TNF-α蛋白表達(dá)水平均上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型組相比，低劑量組和高劑量組Caspase-3、TNF-α蛋白表達(dá)水平均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且高劑量組低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。地塞米松組和高劑量組上述指標(biāo)比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），見表3。

表3 各組小鼠肺組織內(nèi)Caspase-3、TNF-a蛋白表達(dá)

4 討論

本實驗中，低、高劑量組的小鼠氣道壁及平滑肌厚度明顯降低，同時小鼠氣道上皮的炎性損傷也明顯減少；通過對組織的氣道壁和平滑肌厚度檢測發(fā)現(xiàn)，低、高劑量兒咳靈糖漿組和模型組小鼠相比，均能夠顯著抑制肺組織的氣道壁和平滑肌增厚。研究證實，兒咳靈糖漿能夠提高支氣管疾病治療效果，能增加肺部功能[7-9]。

免疫炎癥損傷是支氣管哮喘發(fā)生和發(fā)展的重要機制[10]。TNF-α、IL-6及IL-2屬于常見的炎性因子其表達(dá)水平上調(diào)后能夠增加炎癥級聯(lián)效應(yīng)反應(yīng)，增加機體損傷。本研究顯示，兒咳靈糖漿可以明顯改善支氣管哮喘小鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α表達(dá)水平，說明該藥能夠改善免疫炎癥損傷。目前，已有文獻(xiàn)證實，兒咳靈糖漿能夠顯著降低肺部感染的炎癥因子，而增加臨床療效[11]。

TNF-α調(diào)節(jié)炎癥的主要因子，對哮喘致病機理中的NF-KB信號進(jìn)行活化，并通過該信號對特定的細(xì)胞因子進(jìn)行介導(dǎo)，多種細(xì)胞因子對哮喘患者的肺組織中大量浸潤。TNF-α還可以形成一種自身免疫炎癥反應(yīng)，增加白介素指標(biāo)升高，加重肺纖維化形成[10]。研究表示，對支氣管哮喘小鼠沉默TNF-α受體可緩解肺損傷，說明TNF-α是介導(dǎo)肺損傷的一個關(guān)鍵因子[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，兒咳靈糖漿其可能是通過抑制神經(jīng)氨酸酶、細(xì)菌內(nèi)毒素等與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步抑制血管滲漏及微循環(huán)血栓形成，最終達(dá)到抑制病理損傷的目的[13-14]。Caspase的啟動蛋白酶是Caspase-3，Caspase-3表達(dá)水平與線粒體凋亡有關(guān)，在肺組織中Caspase-3降低，線粒體凋亡功能降低，當(dāng)出現(xiàn)炎癥損傷時，表達(dá)升高，加快肺細(xì)胞凋亡。本研究中，兒咳靈糖漿可以明顯改善支氣管哮喘小鼠肺組織中Caspase-3、TNF-α表達(dá)水平，提示。兒咳靈糖漿可能通過抗凋亡和改善炎癥損傷而發(fā)揮作用。

綜上所述，兒咳靈糖漿給藥能有效降低肺組織的損傷以及Caspase-3和TNF-α的表達(dá)，阻止肺部氣道壁和平滑肌的增厚，改善模型小鼠的哮喘癥狀，從而發(fā)揮保護作用。