血清AFP與超聲聯(lián)合DNA5-羥基胞嘧啶檢測(cè)在原發(fā)性肝癌早期篩查中的臨床應(yīng)用

湯雄　柯云霞　黃潔　方芳　楊高中　袁亮明

【摘要】目的：探究血清甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP）與超聲聯(lián)合DNA5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylation，5-hmC）在原發(fā)性肝癌早期篩查中的臨床應(yīng)用價(jià)值;方法：選擇2019年1月至2019年12月于九江市第三人民醫(yī)院接受診治的80例疑似原發(fā)性肝癌患者為研究對(duì)象，分別對(duì)其開(kāi)展血清AFP、超聲以及5-hmc檢測(cè)，以病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分別評(píng)估3種檢測(cè)方式在原發(fā)性肝癌早期篩查中的應(yīng)用價(jià)值;結(jié)果：血清AFP對(duì)原發(fā)性肝癌診斷一致性、靈敏度和特異度分別為61.25%、48.84%和70.00%，超聲診斷一致性、靈敏度和特異度分別為56.25%、37.21%和78.38%，5-hmc診斷一致性、靈敏度和特異度分別為83.75%、81.40%和86.49%;3種檢測(cè)方式聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌診斷一致性、靈敏度和特異度分別為95.00%、97.67%、91.89%，相較其他聯(lián)合檢測(cè)三種方式聯(lián)合診斷價(jià)值最高（P<0.05）;結(jié)論：血清AFP、超聲和5-hmc檢測(cè)應(yīng)用于原發(fā)性肝癌早期篩查中，可以提高早期肝癌的發(fā)現(xiàn)率。

【關(guān)鍵詞】血清AFP;超聲;5-hmc;原發(fā)性肝癌;早期篩查;臨床應(yīng)用

【中圖分類(lèi)號(hào)】R735.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【DOI】

【基金項(xiàng)目】血清AFP與超聲聯(lián)合DNA5-羥基胞嘧啶檢測(cè)在原發(fā)性肝癌早期篩查中的臨床應(yīng)用;（編號(hào)：20191108;合同編號(hào)：20202042）

肝細(xì)胞癌（HCC）目前是我國(guó)死亡率位居第二的惡性腫瘤，HCC在慢性肝病及肝硬化患者中呈現(xiàn)發(fā)病率高、惡性程度高等相關(guān)特征，70%以上肝癌患者被確診已到中晚期，因此早期的篩查和診斷顯得尤為關(guān)鍵[1]。目前臨床常用篩查方法為AFP和超聲，已有的研究證實(shí)約有30%的肝癌患者AFP為陰性[2]，而超聲檢測(cè)在≤2cm的肝臟腫瘤的靈敏度只有20%[3]。近年來(lái)，表觀遺傳修飾5hmc（5-羥甲基胞嘧啶）的高通量檢測(cè)作為新型、高效的肝癌篩查手段，能夠從肝癌形成的源頭切入檢測(cè)，更早更準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)肝癌，其靈敏度和特異性均高達(dá)90%?？梢宰鳛橐环N早期的篩查分子[3]。本研究擬通過(guò)納入80例疑似肝癌患者并分別分析血清AFP、超聲、5hmc對(duì)原發(fā)性肝癌診斷價(jià)值的方式，進(jìn)一步論證將上述檢測(cè)手段聯(lián)合應(yīng)用于原發(fā)性肝癌鑒別中的臨床意義，以期為原發(fā)性肝癌患者的早期診斷與預(yù)后改善提供臨床參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2019年12月于我院接受診治的80例疑似原發(fā)性肝癌患者為研究對(duì)象。

入組標(biāo)準(zhǔn)：HBV病毒攜帶者有以下任何一項(xiàng)：（1）>40歲的男性，>50歲的女性;（2）肝硬化患者;（3）有肝癌家族史者;（4）其他無(wú)肝硬化的HBV病毒攜帶者，根據(jù)肝炎活動(dòng)嚴(yán)重程度來(lái)判斷是否屬于高危人群。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有肝臟腫瘤;（2）有不穩(wěn)定性心絞痛、癥狀性充血性心衰、嚴(yán)重的心律失常、過(guò)去6個(gè)月有心梗、QT間期延長(zhǎng)（>450ms）;（3）最近5年之內(nèi)出現(xiàn)其他部位的惡性腫瘤;（4）患者不能接受隨訪或正參加其它臨床試驗(yàn)。

1.2 干預(yù)方法

1.2.1血清AFP檢測(cè)

抽取靜脈血3ml，置一次性采血管內(nèi)，充分離心，不應(yīng)有溶血及細(xì)胞顆粒，吸取血清0.2ml至專用杯中并放入DXI800發(fā)光儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2超聲檢查

所有患者在進(jìn)行超聲檢查前8～12h內(nèi)禁食、禁水。檢查時(shí)，患者先采取仰臥位，平穩(wěn)呼吸，兩手上舉置于枕后，然后采取側(cè)臥位或坐位。根據(jù)患者實(shí)際情況，將儀器調(diào)整至最佳狀況，先進(jìn)行常規(guī)肝臟掃查，觀察左右肝葉的形態(tài)改變情況，包膜光滑程度，肝實(shí)質(zhì)回聲增粗、粗糙和分布均勻程度，尋找病灶。

1.2.3Nano 5HmC-Seal技術(shù)

（1）游離DNA提取：按照Quick-cfDNA Serum&Plasma Kit （Zymo）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)從血漿中提取cfDNA，cfDNA樣本需要進(jìn)行回收率質(zhì)控和污染質(zhì)控。

（2）添加接頭：修復(fù)cfDNA或片段化的基因組DNA并與銜接子連接。

（3）5hmC標(biāo)記：使用T4噬菌體酶β-GT將含有疊氮基的工程化葡萄糖部分轉(zhuǎn)移至雙鏈體DNA中的5hmC。

（4）點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)：使用Huisgen Cycloaddition（點(diǎn)擊）化學(xué)，將生物素標(biāo)簽安裝在疊氮基上。

（5）磁珠捕獲：具有生物素標(biāo)簽的含5hmC的DNA片段被抗生素蛋白珠有效捕獲。

（6）PCR擴(kuò)增和二代測(cè)序：常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生文庫(kù)，將獲得的測(cè)序文庫(kù)通過(guò)qPCR進(jìn)行濃度測(cè)定，并用Agilent2100對(duì)文庫(kù)中DNA片段大小含量進(jìn)行確定。將通過(guò)質(zhì)檢的測(cè)序文庫(kù)以相同濃度混合，用Illumina測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序原始數(shù)據(jù)Raw Data經(jīng)得到的clean reads，作為后續(xù)分析的基礎(chǔ)。通過(guò)計(jì)算每個(gè)基因的reads數(shù)。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估，包括對(duì)測(cè)序錯(cuò)誤率、數(shù)據(jù)量等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，評(píng)估建庫(kù)測(cè)序是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，符合標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)冊(cè)進(jìn)行后續(xù)的分析。

（7）確定各基因標(biāo)志物的5hmC含量，將獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行初步質(zhì)控評(píng)估，將達(dá)到測(cè)序質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的獨(dú)段利用Bowtie2工具與人類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)基因組參考序列進(jìn)行比較，繼而確定各基因5hmC含量。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

正常人血清AFP濃度<20ng/ml，本研究以血清AFP濃度≥20ng/

ml為陽(yáng)性;超聲檢測(cè)以發(fā)現(xiàn)病灶為陽(yáng)性;以5-mhc≥5.29%為陽(yáng)性[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以（均值±標(biāo)準(zhǔn)差）或中位數(shù)、四分位間距分布表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)（X 2）。取P<0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清AFP、超聲及5-hmc對(duì)原發(fā)性肝癌診斷價(jià)值分析

以病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估血清AFP對(duì)原發(fā)性肝癌診斷價(jià)值顯示，診斷一致性為61.25%，診斷靈敏度為48.84%，診斷特異度為70.00%，見(jiàn)表1。以病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，超聲對(duì)原發(fā)性肝癌診斷一致性為56.25%，診斷靈敏度為37.21%，診斷特異度為78.38%，見(jiàn)表2。以病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，5-hmc對(duì)原發(fā)性肝癌診斷一致性為83.75%，診斷靈敏度為81.40%，診斷特異度為86.49%，見(jiàn)表3。

2.2 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌診斷價(jià)值分析

分別將血清AFP、超聲以及5-hmc檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)分析，同樣以病理學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估顯示3種檢測(cè)方式聯(lián)合檢測(cè)臨床價(jià)值最優(yōu)，其診斷一致性為95.00%，診斷靈敏度為97.67%，診斷特異度為91.89%，相較其他聯(lián)合檢測(cè)三種方式聯(lián)合診斷價(jià)值最高（P<0.05），見(jiàn)表4。

3 討論

一項(xiàng)調(diào)研指出，國(guó)內(nèi)現(xiàn)有肝癌例數(shù)約35萬(wàn)，占同期癌癥發(fā)病例數(shù)的11.6%左右[4]。肝癌的確切分子機(jī)制目前尚不清晰，但多數(shù)研究指出病毒感染、飲水污染、酒精、肝硬化等都與肝癌的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。DNA羥甲基化修飾是指10-11易位（ten-eleven translocation，TET）蛋白家族通過(guò)氧化5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mc）生成5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylation，5-hmc），使基因甲基化狀態(tài)終止[5]。本研究通過(guò)將80例疑似肝癌患者納入研究并分別實(shí)施血清AFP、超聲以及5-hmc檢測(cè)的方式，就上述3種措施聯(lián)合檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌診斷價(jià)值進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，單純血清AFP對(duì)原發(fā)性肝癌診斷一致性、靈敏度和特異度分別為61.25%、48.84%和70.00%，超聲診斷一致性、靈敏度和特異度分別為56.25%、37.21%和78.38%，5-hmc診斷一致性、靈敏度和特異度分別為83.75%、81.40%和86.49%。將血清AFP、超聲以及5-hmc聯(lián)合檢測(cè)后再次分析顯示，聯(lián)合檢測(cè)一致性、靈敏度和特異度分別為95.00%、97.67%、91.89%，同任一單純檢測(cè)方式相比較，3種方式聯(lián)合檢測(cè)的臨床價(jià)值顯著更優(yōu)。國(guó)內(nèi)楊國(guó)華[6]的研究顯示，TET家族可以催化5mc出現(xiàn)連續(xù)氧化反應(yīng)，通過(guò)羥化形成5hmc，而該過(guò)程可以轉(zhuǎn)化胞嘧啶，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)DNA的去甲基化，這也是誘發(fā)細(xì)胞惡變的重要原因之一。

本文作者分析認(rèn)為，5hmC是5mC主動(dòng)去甲基化過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物，被稱為“第六種DNA堿基”，5hmC參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，能夠?qū)崟r(shí)動(dòng)態(tài)地反映癌癥相關(guān)的基因表達(dá)活性，盡管肝癌早期或極早期腫瘤組織釋放入血的循環(huán)腫瘤DNA量很低，但5hmC化學(xué)標(biāo)記捕獲技術(shù)在循環(huán)腫瘤DNA低至1ng情況下仍有穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果，本研究通過(guò)聯(lián)合血清AFP、超聲以及5hmc的方式，為原發(fā)性肝癌的診治提供了新的思路舉措，可以篩查和診斷早期的肝癌患者，為提高患者的生存期打下良好基礎(chǔ)。

綜上所述，血清AFP、超聲和5-hmc檢測(cè)應(yīng)用于原發(fā)性肝癌早期篩查中，可以提高早期肝癌的發(fā)現(xiàn)率。

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作者簡(jiǎn)介：

湯雄（1964.11.11-），男，漢族，江西，主任醫(yī)師，科主任，本科，研究方向：肝病臨床和基礎(chǔ)研究。