FNA樣本BRAF V600E基因突變檢測(cè)對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)定性診斷的應(yīng)用價(jià)值

姜燕平 荀延萍 傅佳儀

超聲引導(dǎo)下進(jìn)行細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查（fine needle aspiration，F(xiàn)NA），為當(dāng)前鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)最常用手段，具有準(zhǔn)確性高、微創(chuàng)以及易操作等優(yōu)點(diǎn)，但依然存在10%～40%的甲狀腺結(jié)節(jié)難以經(jīng)FNA 明確診斷[1]。BRAF V600E基因突變?yōu)槟壳皥?bào)道最多的一種甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）突變類型。以往研究指出，BRAF V600E基因突變檢測(cè)能夠輔助細(xì)胞學(xué)診斷[2]。本文以98 個(gè)甲狀腺結(jié)節(jié)FNA樣本為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討甲狀腺結(jié)節(jié)FNA樣本檢測(cè)BRAF V600E基因突變?cè)诹紣盒远ㄐ栽\斷中的應(yīng)用價(jià)值，以期為提高甲狀腺結(jié)節(jié)診斷準(zhǔn)確性提供有效途徑應(yīng)用依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2015 年1 月—2020 年2 月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院接受FNC檢測(cè)的甲狀腺結(jié)節(jié)患者98 例，其中男29 例，女69例，年齡25～72（46.83±8.65）歲，結(jié)節(jié)直徑0.7～2.6（1.09±0.20）cm。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）單個(gè)結(jié)節(jié)；（2）有FNA 指征[3]：①經(jīng)過超聲檢查發(fā)現(xiàn)可疑惡性征象：病灶形態(tài)不規(guī)則，且其縱橫比值超過1，邊界顯示不清，中央型血流，呈現(xiàn)極低回聲以及微鈣化；②病灶最大徑超過0.5cm；③未合并全身器質(zhì)性疾病或者出血性疾病等；（3）資料完整；（4）對(duì)研究知情，簽署研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并精神疾??；（2）伴凝血功能障礙；（3）具有其他腫瘤病史；（4）合并嚴(yán)重冠心病、高血壓或者糖尿病等。

2 方 法

2.1 FNA 檢查方法 FNA 前采取常規(guī)超聲檢查方式確定目標(biāo)；對(duì)于手術(shù)治療者，予以常規(guī)病理檢查。

超聲引導(dǎo)下FNA：指導(dǎo)患者處于仰臥位（穿刺體位），適當(dāng)墊高頸部，保持頭適當(dāng)后仰，充分暴露頸部，常規(guī)探查甲狀腺結(jié)節(jié)部位并定位于頸部體表，常規(guī)消毒、鋪巾后，采取常規(guī)超聲技術(shù)確定進(jìn)針部位、具體角度與深度。手握探頭的同時(shí)，適當(dāng)固定加壓，且以另一手持針進(jìn)針，注意穿刺路線與超聲探頭表面長(zhǎng)軸之間30°～40°。順利進(jìn)入目標(biāo)后，在超聲引導(dǎo)下用穿刺針分3 次穿入腫塊內(nèi)，并做到快速拔針，取出血性液體少許，仔細(xì)把針內(nèi)容物推至相應(yīng)玻片上涂片，并將其快速固定好，肉眼觀察，判斷所取標(biāo)本是否足夠，確認(rèn)無誤后予以細(xì)胞學(xué)病理檢測(cè)。

細(xì)胞學(xué)病理診斷結(jié)果包括：（1）穿刺樣本量較少；（2）考慮屬于良性病變；（3）無法明確意義的病變；（4）診斷為嗜酸性腫瘤病變或?yàn)V泡性腫瘤病變；（5）可疑惡性腫瘤病變；（6）惡性腫瘤病變。其中（1）～（4）評(píng)估為細(xì)胞學(xué)陰性，（5）～（6）評(píng)估為細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性。BRAF V600E基因突變檢測(cè)：選擇福建廈門艾德人類BRAF基因V600E 突變檢測(cè)試劑盒，采用熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法。引物序列如下：正義引物序列為5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3'；反義引物序列為5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3'，引物序列的設(shè)計(jì)、合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司負(fù)責(zé)。DNA抽提采用福建廈門艾德核酸提取試劑盒（型號(hào)：FFPE DNA)，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，可以將檢測(cè)結(jié)果分為兩種：野生型（未發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，見圖1）以及突變型（發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，見圖2）。

圖1 野生型樣本擴(kuò)增曲線圖

圖2 突變型樣本擴(kuò)增曲線圖

2.2 觀察指標(biāo) 以明確細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果或常規(guī)病理診斷為“金標(biāo)準(zhǔn)”，觀察BRAF V600E基因突變檢測(cè)鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性敏感度、特異度及準(zhǔn)確性。敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%；準(zhǔn)確性=（真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/檢出的總陽(yáng)性例數(shù)×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/檢出的總陰性例數(shù)×100%。觀察常規(guī)病理學(xué)診斷情況，分析BRAF V600E基因突變與PTC 臨床特征關(guān)系。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以（%）表示，使用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Kappa 檢驗(yàn)法進(jìn)行一致性分析，中等一致性：Kappa 值范圍為0.41～0.60，高度一致性：Kappa 值范圍為0.61～0.80，幾乎完全一致：Kappa值超過0.80。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞學(xué)檢查與常規(guī)病理結(jié)果 明確細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果或常規(guī)病理診斷顯示78 個(gè)PTC，20 個(gè)良性結(jié)節(jié)89.74%（70/78）；PTC 顯示BRAF V600E基因突變型10.26%（8/78），顯示野生型。

3.2 BRAF V600E基因突變檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照結(jié)果BRAF V600E基因突變檢測(cè)診斷敏感度89.74%（70/78），特異度100.00%（20/20），準(zhǔn)確性91.84%（90/98），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100.00%（70/70），陰性預(yù)測(cè)值71.43%（20/28），Kappa 值0.78。見表1。

表1 BRAF V600E基因突變檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照（例）

3.3 常規(guī)病理學(xué)診斷分析 細(xì)胞學(xué)病理檢查無法明確結(jié)節(jié)8 個(gè)，經(jīng)過手術(shù)常規(guī)病理檢查，證實(shí)為4 例PTC（其中1 例為野生型，3 例突變型）與4 例良性結(jié)節(jié)（均為野生型）。

3.4 BRAF V600E基因突變與PTC 臨床特征關(guān)系38 例PTC 予以手術(shù)治療，并行常規(guī)病理檢查（均顯示PTC），其中30 例為BRAF V600E基因突變型，8 例野生型。突變型與野生型PTC 患者性別、年齡、甲狀腺包膜侵犯率、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、橋本甲狀腺炎發(fā)生率、腫瘤最大徑比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 BRAF V600E基因突變與PTC 臨床特征關(guān)系

4 討論

FNA 診斷范圍受到細(xì)胞學(xué)形態(tài)限制，無法全面了解病變類型，故其檢查結(jié)果依然存在一定不確定性。對(duì)于某些細(xì)胞學(xué)無法確診甲狀腺結(jié)節(jié)，一般惡性可能性為5%～10%，甚至可達(dá)50%～75%[4]。

研究表明，甲狀腺癌BRAF基因相關(guān)突變位點(diǎn)里面，BRAF V600E 位點(diǎn)發(fā)生突變?yōu)楫?dāng)前最常見的一種變異表達(dá)形式，在各種BRAF 突變中，其比例高達(dá)95%[5]。BRAF V600E基因突變主要出現(xiàn)于經(jīng)典型PTC，在濾泡癌以及髓樣癌中較為罕見，且在甲狀腺良性結(jié)節(jié)檢測(cè)中未發(fā)現(xiàn)這種突變，故臨床普遍PTC最常見，具有較高特異性的一種基因異常為BRAF基因突變[6-7]。文獻(xiàn)報(bào)道，甲狀腺結(jié)節(jié)FNA樣本測(cè)定患者BRAF V600E基因突變情況，是術(shù)前PTC 特異性非常高的診斷手段[8]。本研究結(jié)果顯示，BRAF V600E基因突變檢測(cè)方式診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性敏感度89.74%，特異度100.00%，準(zhǔn)確性91.84%，Kappa 值高達(dá)0.78，與上述報(bào)道觀點(diǎn)相符。說明BRAF V600E基因突變檢測(cè)具有較高診斷準(zhǔn)確性，與病理診斷幾乎完全一致。對(duì)于FNA 中病理意義不明確甲狀腺結(jié)節(jié)，若經(jīng)BRAF V600E基因檢測(cè)顯示為突變型，則更益于PTC 診斷[9]。當(dāng)前，以BRAF V600E基因突變情況和PTC 侵襲性關(guān)系為主要研究?jī)?nèi)容的報(bào)道結(jié)果爭(zhēng)議較大。相關(guān)研究表明，BRAF V600E基因突變可預(yù)測(cè)PTC 存在侵襲性，包括腫瘤更高分期、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及包膜侵犯等[10]。然而，亦有研究顯示，BRAF V600E基因突變的發(fā)生和PTC 侵襲性之間沒有顯著相關(guān)性[11]。相關(guān)研究指出，相較于BRAF V600E基因野生型PTC，突變型PTC 患者甲狀腺包膜侵犯出現(xiàn)率更高，但是在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率方面不存在顯著差異[12]。本研究中，突變型與野生型PTC 患者甲狀腺包膜侵犯率、中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率以及橋本甲狀腺炎發(fā)生率比較無顯著差異，BRAF V600E基因突變檢測(cè)并不能預(yù)測(cè)PTC 患者甲狀腺包膜侵犯以及中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，與上述報(bào)道結(jié)果并不完全一致?？赡芘c本次研究樣本量較少，具有一定局限性有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)NA樣本檢測(cè)BRAF V600E基因突變對(duì)于診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性具有重要價(jià)值，然而其不能預(yù)測(cè)PTC 甲狀腺包膜侵犯或者中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。