湖州地區(qū)獻(xiàn)血人群隱匿性乙型肝炎病毒感染的血清學(xué)特征及分子機(jī)制研究

莫艷萍 施旭斌 費(fèi)靜嫻 楊海英

全球約有3 億人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），我國(guó)為HBV 高流行區(qū)，HBV 感染率約占33%[1]。雖隨乙肝疫苗接種的普及，HBV 母嬰傳播減少，人群乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）攜帶率降低，但一般人群HBsAg 陽(yáng)性率仍高達(dá)7.1%[2]。以往常將血清HBsAg 陽(yáng)性作為判定是否感染HBV 的依據(jù)。自首例報(bào)道HBsAg 陰性供血者血液引起HBV 感染以來(lái)，血清HBsAg 轉(zhuǎn)陰代表HBV 清除的觀點(diǎn)受到質(zhì)疑。后續(xù)較多報(bào)道均提出隱匿性HBV 感染（Occult HBV infection，OBI）現(xiàn)象存在，且OBI 被認(rèn)為是導(dǎo)致輸血傳播HBV 的關(guān)鍵原因，此類患者除血清轉(zhuǎn)換前的窗口期外，機(jī)體均存在HBV DNA，但HBsAg 無(wú)法檢出感染，常表現(xiàn)為陰性，乙型肝炎核心抗體（hepatitis B core antibody，抗-HBc）呈陽(yáng)性或陰性[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，OBI 與獻(xiàn)血者HBV 再激活及受血者輸血感染HBV 有關(guān)，獻(xiàn)血人員隱匿性HBV 感染可能為HBV 傳播潛在傳染源[5]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，OBI 在不同地區(qū)、不同人群中流行存在區(qū)別，病毒基因型分布存在地域特點(diǎn)[6]。發(fā)生OBI 分子學(xué)機(jī)制可能與小S基因變異有關(guān)[7]。本研究分析浙江省湖州地區(qū)獻(xiàn)血人群OBI 數(shù)據(jù)，以了解當(dāng)?shù)責(zé)o償獻(xiàn)血人群中OBI 血清學(xué)特點(diǎn)及分子生物學(xué)特征，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018 年1 月—2019 年9 月浙江省湖州市中心血站無(wú)償獻(xiàn)血者獻(xiàn)血標(biāo)本，均符合獻(xiàn)血者健康檢查要求（GB18467-2011）中相關(guān)規(guī)定[8]。全部樣本經(jīng)HBsAg 與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）初篩合格后，采集肘靜脈血標(biāo)本7mL，抗凝后保存。OBI 確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)：HBsAg 陰性，核酸檢測(cè)（NAT）陽(yáng)性，補(bǔ)充鑒別試驗(yàn)HBsAg 陰性，HBV-DNA 陽(yáng)性；血液標(biāo)本乙肝表面標(biāo)志物1 種或多種跟蹤、回溯時(shí)無(wú)明顯改變；乙肝血清表面標(biāo)志物全陰，追蹤回溯仍全陰[9]。共獲得30 份HBsAg 陰性而NAT 陽(yáng)性標(biāo)本，作為OBI 組。并收集30 份HBsAg初、復(fù)檢均陽(yáng)性而NAT 陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.2 主要試劑與儀器 HBsAg 診斷試劑盒[酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），初篩：上?？迫A生物工程股份有限公司（2016716），復(fù)篩：美國(guó)雅培公司（YS02190B）]，乙型肝炎表面抗體（hepatitis B surface antibody，抗-HBs）、乙型肝炎e 抗原（hepatitis B E antigen，HBeAg）、乙型肝炎e抗體（hepatitis B E antibody，抗-HBe）、抗-HBc 檢測(cè)試劑盒[初篩：電化學(xué)發(fā)光法，瑞士羅氏公司（182213、150464、044258、179963）；復(fù)篩：ELISA 法，美國(guó)雅培公司（J05475、J04829、J05675、J12475）]，ALT 檢測(cè)試劑盒[初篩：上?？迫A生物工程股份有限公司（150494），復(fù)篩：澳斯邦生物工程有限公司（J26471）]，HBV 病毒DNA 提取試劑盒（購(gòu)自瑞士羅氏公司，K00918），HBV 病毒載量定量測(cè)定試劑盒（購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，152513），TaKaRa Taq/TaKaRa LA Taq（均購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司），Expand High Fidelity PCR system（瑞士羅氏公司），病毒核酸擴(kuò)增檢測(cè)（nucleic acid amplification test，NAT）篩查試劑盒[初篩：上海浩源生物科技有限公司（181365）；復(fù)篩：瑞士羅氏公司（K00918）]；諾華TIGRIS 全自動(dòng)NAT 儀（購(gòu)自美國(guó)諾華公司），Xantus-200型全自動(dòng)加樣儀（購(gòu)自瑞士Sias 公司），Microlab FAME 全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)（購(gòu)自瑞士Hamilton 公司），cobas e411型電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（購(gòu)自美國(guó)羅氏公司），ABI 9700型巢式（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀（購(gòu)自德國(guó)ABI 公司），電泳儀（北京六一儀器廠）；引物設(shè)計(jì)及合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 方 法

1.3.1 血清學(xué)檢測(cè) 全部血樣均由浙江省湖州市中心血站收集，采用ELISA 法進(jìn)行HBsAg 檢測(cè)，所有血樣均采用國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口雙試劑初篩與復(fù)篩，所有血源性篩查試劑盒均為國(guó)家制定權(quán)威機(jī)構(gòu)批檢合格，嚴(yán)格按試劑盒使用說(shuō)明操作，判讀結(jié)果。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc，抗-HBc復(fù)篩采用ELISA 法，初篩、復(fù)篩結(jié)果均陽(yáng)性判定為抗-HBc 陽(yáng)性。

1.3.2 NAT 檢測(cè) 排除血清學(xué)檢查不合格樣本，采用諾華TIGRIS 全自動(dòng)NAT 檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行三聯(lián)熒光病毒單人份NAT 檢測(cè)，對(duì)ELISA 陰性但NAT 陽(yáng)性的反應(yīng)性標(biāo)本補(bǔ)充做核酸鑒別試驗(yàn)，鑒別試驗(yàn)結(jié)果為HBV DNA 陽(yáng)性，最終判定為HBsAg陰性，HBV DNA 陽(yáng)性。

1.3.3 HBV 病毒提取及定量檢測(cè) 參照HBV基因提取試劑盒提取OBI樣本HBV DNA 核酸，取200μL HBsAg 陰性/HBV DNA 陽(yáng)性標(biāo)本，并選擇HBsAg 陽(yáng)性、HBV DNA 雙陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，提取450μL DNA 抽提液+4μL 內(nèi)標(biāo)溶液自離心管內(nèi)，HBV 質(zhì)控樣品購(gòu)自北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司，振蕩混勻，瞬時(shí)離心，100℃溫浴10min，冷卻5min，13800g 離心5min，取上清液20μL 加入PCR反應(yīng)孔，上PCR 儀進(jìn)行HBV-DNA 定量分析，反應(yīng)體系：模板DNA 5μL+上下游引物各1.5μL+DNA Mix 12.5μL+探針0.4μL+雙蒸水補(bǔ)足至25μL，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 10min，95℃ 30s，55℃ 60s，42個(gè)循環(huán)。

1.3.4 HBV S 區(qū)基因擴(kuò)增與測(cè)序 preSS 區(qū)基因半巢式PCR 擴(kuò)增，未擴(kuò)增成功樣本繼續(xù)行S 區(qū)巢式PCR 擴(kuò)增（引物見表1），preSS 區(qū)擴(kuò)增體系（第1輪）：LA 10×Buffer 2μL+dNTP 0.8μL+上下游引物各0.4μL+LA Taq 0.2μL+超純水11.2μL+模板5μL，反應(yīng)條件：94℃4min，94℃30s，58℃30s，72℃3min，34 個(gè)循環(huán)，72℃10min。第2 輪反應(yīng)體系：LA 10×Buffer 2μL+dNTP 0.8μL+上下游引物各0.4 μL+LA Taq 0.2μL+超純水14.2μL+模板2μL，反應(yīng)條件：94℃ 4min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 3min，24 個(gè)循環(huán)，72℃10min。S 區(qū)擴(kuò)增體系（第1 輪）：10×NH4 Buffer 2μL+50mM MgCl2 1μL+dNTP 0.25μL+上下游引物各2μL+BioTaq 0.5μL+超純水2.25μL+模板10μL，反應(yīng)體系（第1 輪）：10×NH4 Buffer 2μL+50mM MgCl2 1μL+dNTP 0.25μL+上下游引物各2μL+BioTaq 0.25μL+超純水7.5μL+模板5μL，反應(yīng)條 件：95℃ 2min，94℃ 20s，55℃ 30s，72℃ 45s，38個(gè)循環(huán)，72℃10min，擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性條帶切膠回收，回收產(chǎn)物送檢測(cè)序。

表1 引物序列

1.3.5 OBI樣品基因分型 登錄NCBI 網(wǎng)站genotyping 頁(yè)面對(duì)測(cè)序獲得序列進(jìn)行HBV基因分型，采用MEGA 5.2 軟件對(duì)OBI 組與陽(yáng)性對(duì)照組核苷酸、氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間t 檢驗(yàn)，多組比較方差分析，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)率（%）表示，組間率比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率分析，雙側(cè)P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 湖州市無(wú)償獻(xiàn)血標(biāo)本OBI 檢出情況、一般資料及血清學(xué)特點(diǎn) 2018 年1 月—2019 年9 月浙江省湖州市中心血站共采集無(wú)償獻(xiàn)血標(biāo)本109560 份，其中HBsAg 初、復(fù)篩均陰性而NAT 陽(yáng)性標(biāo)本共檢出30 份，檢出率為0.027%（30/109560）。OBI 血清學(xué)模式：抗-HBc（+）/抗-HBs（-）12 例（40.00%），抗-HBs（+）/抗-HBc（+）8 例（26.67%），抗-HBs（+）/抗-HBc（-）3 例（10.00%），抗-HBc（-）/抗-HBs（-）7 例（23.33%），不同血清學(xué)模式OBI 患者年齡、性別、ALT、獻(xiàn)血次數(shù)等資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 浙江省湖州市OBI 無(wú)償獻(xiàn)血者一般資料與血清學(xué)特點(diǎn)

2.2 湖州市無(wú)償獻(xiàn)血者OBI 血樣本血清學(xué)特點(diǎn)30 份OBI 標(biāo)本HBV-DNA 病毒載量區(qū)間為8～1751（中位數(shù)268.33）IU/mL，ALT 范圍為10～36（中位數(shù)18.13）U/L，見表3。

表3 浙江省湖州市無(wú)償獻(xiàn)血者OBI 血樣本血清學(xué)篩查結(jié)果

2.3 湖州市無(wú)償獻(xiàn)血者OBI 血樣本分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果 30 份OBI 無(wú)償獻(xiàn)血樣本中29 份（96.67%）標(biāo)本S 區(qū)擴(kuò)增成功，2 份（6.67%）全基因型擴(kuò)增成功，23 份（76.67%）BCP/PC 擴(kuò)增成功，S 區(qū)、BCP/PC兩個(gè)片段均擴(kuò)增成功22 份（73.33%）；基因型分型：B型23 例（76.67%），C型5 例（16.67%），未明確分型2例（6.67%）；血清型：adw 共24 例（80.00%），adr 共5例（16.67%），ayr 共1 例（3.33%），見表4。

表4 浙江省湖州市OBI 無(wú)償獻(xiàn)血者樣本分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.4 OBI 組與陽(yáng)性對(duì)照組HBV基因型分布比較OBI 組與陽(yáng)性對(duì)照組HBV基因型均以B基因型占優(yōu)勢(shì)，兩組基因型分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

表5 OBI 組與陽(yáng)性對(duì)照組HBV基因型分布比較[例（%）]

2.5 OBI 組與陽(yáng)性對(duì)照組S 區(qū)序列結(jié)果比較 采用MEGA 5.2 軟件將獲得OBI 組獲得序列與陽(yáng)性對(duì)照組序列進(jìn)行同源性比對(duì)，序列范圍為NT241～685，片段長(zhǎng)度445bp，翻譯為氨基酸序列33～177AA，兩組小S 區(qū)基因HBsAg 主要親水結(jié)構(gòu)域氨基酸突變情況（見表6）。OBI 組29 例擴(kuò)增、測(cè)序成功，小S 區(qū)18例（62.07%）均伴不同程度氨基酸突變，2 例（6.90%）OBI 提前形成終止密碼子；陽(yáng)性對(duì)照組小S區(qū)10 例（33.33%）出現(xiàn)氨基酸突變，變異位點(diǎn)與OBI不相同，1 例（3.33%）提前形成終止密碼子，OBI 組S區(qū)突變率高于陽(yáng)性對(duì)照組（χ2=4.883，P=0.027）。

表6 OBI 組與陽(yáng)性對(duì)照組S 區(qū)序列結(jié)果對(duì)比[例（%）]

3 討論

國(guó)內(nèi)相關(guān)統(tǒng)計(jì)報(bào)道，無(wú)償獻(xiàn)血人員OBI 發(fā)生率為0.7%～10.6%[10]。本文共收集浙江省湖州市中心血站無(wú)償獻(xiàn)血標(biāo)本109560 份，OBI 檢出30 份，檢出率為0.027%，較上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果偏低，考慮可能與地域差別及OBI 界定區(qū)別有關(guān)，上述調(diào)查HBsAg 檢測(cè)均使用國(guó)產(chǎn)試劑盒，可能出現(xiàn)HBsAg 假陰性結(jié)果。且可能僅檢測(cè)HBV 病毒X 區(qū)基因組，導(dǎo)致假陽(yáng)性率增加。而本研究中均使用兩種試劑盒對(duì)HBV 感染情況進(jìn)行初篩、復(fù)篩，可減少假陽(yáng)性出現(xiàn)可能，并通過ELISA 法、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清標(biāo)志物，可提高HBsAg 檢測(cè)敏感度與特異度。

前期研究發(fā)現(xiàn)，血清學(xué)模式中抗-HBc 陽(yáng)性患者有更高的OBI 檢出率，尤其單獨(dú)抗-HBc 陽(yáng)性者[11]。本次調(diào)查顯示，湖州市中心血站檢出30 份隱匿性HBV 感染血標(biāo)本中抗-HBc（+）/抗-HBs（-）12 例，占40.00%，抗-HBs（+）/抗-HBc（+）8 例，占26.67%，其ALT 均處于正常范圍，HBV-DNA 病毒載量較低，支撐上述研究結(jié)果，說(shuō)明抗-HBc 陽(yáng)性獻(xiàn)血者HBV 隱匿性感染風(fēng)險(xiǎn)較高，常呈現(xiàn)ALT 正常，HBV-DNA 病毒載量較低的特點(diǎn)。但本研究此項(xiàng)結(jié)果與Zhang 等[7]報(bào)道的HBV 低流行地區(qū)OBI 抗-HBc 陽(yáng)性率較低的結(jié)論存在差別，可能與不同地域HBV 流行性特點(diǎn)存在區(qū)別有關(guān)，但仍提示抗-HBc 陽(yáng)性獻(xiàn)血者體內(nèi)HBV DNA 存在風(fēng)險(xiǎn)較大，需引起重視。且本研究發(fā)現(xiàn)，不同血清組OBI 患者年齡、性別、ALT、HBVDNA 病毒載量及獻(xiàn)血情況等資料均無(wú)明顯差別，考慮可能與本組OBI 獻(xiàn)血前均已完成ALT、HBsAg 初步篩查有關(guān)。在基因型分布方面，本研究OBI 組主要以B型為主，與陽(yáng)性對(duì)照組基因型分布類似，支撐葉賢林等[12]研究提出南方地區(qū)HBV基因型主要為B型的結(jié)論。血清學(xué)分型方面，OBI 均以adw型為主，ayr 相對(duì)少見，與呂瑩等[13]調(diào)查結(jié)果一致。

目前對(duì)OBI 發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明。有研究認(rèn)為，S 區(qū)基因突變所致氨基酸變異與OBI 發(fā)生密切相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，OBI 組S 區(qū)基因變異所引起氨基酸改變共18 例，占62.07%，高于陽(yáng)性對(duì)照組，支持上述結(jié)果。說(shuō)明OBI 發(fā)生與HBV DNA S 區(qū)基因位點(diǎn)突變有關(guān)。S 蛋白含2 個(gè)親水區(qū)，系HBsAg 重要表面抗原位點(diǎn)，引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的作用。該基因第二個(gè)親水區(qū)含HBsAg 抗原決定簇“α”決定簇基因，同時(shí)也是乙肝疫苗關(guān)鍵保護(hù)性表位及乙肝免疫球蛋白關(guān)鍵靶點(diǎn)，對(duì)維持HBsAg 抗原性有重要作用，影響乙肝疫苗、乙肝免疫球蛋白藥效及效力，可保護(hù)機(jī)體免受病毒感染[15]。單個(gè)或多個(gè)氨基酸變異均可改變其抗原性，導(dǎo)致氨基酸突變，HBV 野毒株無(wú)法產(chǎn)生中和性抗體，造成HBsAg 亞型改變，引起OBI。此類患者變異后，HBsAg 血清濃度低或抗原性改變，通常難以檢出，導(dǎo)致機(jī)體單純呈抗-HBs 陽(yáng)性或抗-HBc 和抗-HBs 同時(shí)陽(yáng)性。

近年研究顯示，OBI 親水區(qū)存在較多典型突變位點(diǎn)，包括G145R、P120T、G119R 等[16]。其中G145R為常見突變位點(diǎn)，與S 區(qū)變異所致免疫逃逸有密切關(guān)聯(lián)，直接影響HBsAg 免疫測(cè)試試劑反應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)，OBI 組S 區(qū)變異中G145R 出現(xiàn)頻率較高，支持以上結(jié)論，說(shuō)明此位點(diǎn)突變可能對(duì)HBsAg 試劑檢測(cè)能力產(chǎn)生影響，導(dǎo)致HBsAg 陰性結(jié)果，影響HBV感染判斷。此外，本研究也顯示，無(wú)償獻(xiàn)血人群OBI存在多個(gè)常見突變位點(diǎn)，包括P105R、S114A、S31N、1150F 等，考慮上述位點(diǎn)氨基酸改變可造成HBsAg活性變化，影響HBV 病毒復(fù)制、分泌，干擾HBV 感染能力，說(shuō)明OBI 發(fā)生的機(jī)制可能與多基因綜合改變有關(guān)。

綜上所述，浙江省湖州市獻(xiàn)血人員中OBI 檢出率為0.027%，抗-HBc 陽(yáng)性患者OBI 感染率較高，HBV基因型分布以B型為主；HBV S 區(qū)基因變異，尤其是HBsAg“α”決定簇氨基酸改變可能為OBI 感染的重要分子學(xué)機(jī)制，可作為OBI 分子研究的新方向。同時(shí)還需注意由于OBI 的存在對(duì)輸血安全造成較大隱患，因此，有必要將ELISA 法、NAT 檢測(cè)引入血液篩檢體系，以確保輸血安全。但由于本研究所收集OBI 病例數(shù)較少，后續(xù)將收集更多樣本以進(jìn)一步補(bǔ)充完善該結(jié)論。