電針?biāo)疁涎▽δX梗死模型大鼠腦血管平滑肌Calponin 和Caldesmon 表達(dá)的影響

李 蕾 張 瀲 范立紅 周莎白 趙 晶 歐陽侃

腦梗死又稱缺血性腦卒中，是臨床常見的難治性疾病，改善腦循環(huán)是治療腦梗死的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮是目前研究的熱點[1]。腦血管平滑肌鈣樣蛋白（Calponin）和鈣調(diào)結(jié)合蛋白（Caldesmon）是缺血狀態(tài)下調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮運(yùn)動的重要信號通路因子[2]。本研究采用腔內(nèi)線栓法阻滯大鼠左側(cè)大腦中動脈，制備腦梗死模型，以水溝穴作為醒腦開竅針刺法的主穴，研究電針對腦梗死大鼠腦血管平滑肌Calponin、Caldesmon 表達(dá)的影響，探討電針治療腦梗死作用機(jī)制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雌性Wistar 大鼠78只，體質(zhì)量（180±10）g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0006。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)，采用代謝籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。動物飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置：室溫24℃，濕度45%～75%。實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012，本實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審核通過（批號IACUC-2018121706）。

1.2 主要試劑及儀器 Calponin 抗體（Abcam 公司，美國，批號46794）；Caldesmon 抗體（Abcam 公司，美國，批 號32330）；Goat anti-Rabbit IgG Antibody（biosharp 公司，中國，批號BL003A）；RIPA 裂解液（批號P0013D）、BCA 試劑盒（批號P0011）購自上海碧云天生物技術(shù)公司；ECL 發(fā)光試劑盒（Merck Millipore 公司，美國，批號1822101）；激光多普勒血流儀（瑞典百靈威中國公司，型號：Periflux System 5000）；康嶺電針儀（揚(yáng)州康嶺醫(yī)用電子儀器有限公司，型號：G91-E）；高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf AG 公司，型號：5427R）；數(shù)碼凝膠圖像分析處理系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號：GIS－2008）。

1.3 動物分組及模型建立 78 只大鼠，手術(shù)前禁食12h，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組6 只，模型組、電針組、假手術(shù)組各24 只。造模方法[3]：將大鼠置于仰臥位，腹膜內(nèi)注射10%水合氯醛（3mL/kg 體質(zhì)量）。沿頸部正中偏左側(cè)切口，依次分離出左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，然后在頸總動脈近心端、頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處放置動脈夾。在兩動脈夾之間用1mL 注射器扎一個小孔，選擇直徑為0.204mm的尼龍線栓插入小孔，插入后放開頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉處動脈夾，接著繼續(xù)插入線栓，總計長度為18～22mm，線栓進(jìn)入頸內(nèi)動脈至稍遇阻力即停止進(jìn)線，結(jié)扎線栓。假手術(shù)組大鼠除不插入線栓外，其余步驟相同；空白組大鼠除同樣抓取固定外，不做任何處理。

1.4 干預(yù)方法 電針組大鼠水溝穴定位以實驗針灸穴位標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)[4]，使用“華佗牌”毫針刺入大鼠鼻中隔2mm，并在該部位下約2mm 處刺入一針作為參考電極，水溝穴接電針儀的正極，參考電極接負(fù)極，用15Hz、1mA、連續(xù)波電刺激持續(xù)20min。模型組、假手術(shù)組、空白組大鼠在相應(yīng)時間段內(nèi)，同樣抓取固定，不進(jìn)行電針干預(yù)。

1.5 標(biāo)本取材 模型組、電針組和假手術(shù)組大鼠分別于造模后0.5、1、3、6h 各處死6 只，空白組大鼠于6h 后處死。分別剝離大鼠大腦，在外科顯微鏡下分離和剪取梗死側(cè)的大腦動脈。

1.6 免疫印跡法觀察大鼠腦血管平滑肌Calponin 和Caldesmon 表達(dá) 用RIPA 裂解液抽提蛋白，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定后，各樣品取20μg，加等量樣本處理液后，100℃煮沸5min，Calponin 采 用12% SDS－PAGE 變 性 電 泳，Caldesmon 采用8% SDS－PAGE 變性電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)置硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 液封閉2h，而后加入含一抗的封閉液（Calponin抗體稀釋度1∶5000；Caldesmon 抗體稀釋度1∶6000）4℃恒溫室搖床孵育過夜，洗去抗體后加入含二抗的封閉液（比例1∶2000），室溫?fù)u床作用1～2h。洗去抗體后按ECL 發(fā)光試劑盒說明依次進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，顯影，定影。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的凈光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較行LSD 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腦血管平滑肌Calponin 表達(dá)水平比較與假手術(shù)組比較，模型組大鼠1、3、6h Calponin 表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）；與模型組比較，電針組大鼠3、6h Calponin 表達(dá)上調(diào)（P 均＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠腦血管平滑肌Calponin 表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組大鼠腦血管平滑肌Calponin 表達(dá)水平比較（±s）

注：電針組給予水溝穴電針干預(yù)；模型組插線栓不電針；空白組和假手術(shù)組僅抓取固定，不進(jìn)行電針干預(yù)；Calponin 為肌鈣樣蛋白；“-”為無此項數(shù)據(jù)；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

2.2 各組大鼠腦血管平滑肌Caldesmonn 表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠1、3、6h Caldesmonn 表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），與模型組比較，電針組大鼠1、3、6h 表達(dá)均上調(diào)（P 均＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦血管平滑肌Caldesmon 表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠腦血管平滑肌Caldesmon 表達(dá)水平比較（±s）

注：電針組給予水溝穴電針干預(yù)；模型組插線栓不電針；空白組和假手術(shù)組僅抓取固定，不進(jìn)行電針干預(yù)；Caldesmon 為鈣調(diào)結(jié)合蛋白；“-”為無此項數(shù)據(jù)；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

3 討論

研究表明，缺血性中風(fēng)患者急性期進(jìn)行針刺治療可抑制炎性因子產(chǎn)生，起到保護(hù)腦組織、恢復(fù)腦細(xì)胞神經(jīng)功能的作用[5-6]。針刺亦可以通過調(diào)節(jié)腦血管舒縮，達(dá)到促進(jìn)腦循環(huán)而治療腦梗死的效果[7]。

水溝穴是“醒腦開竅”針法的重點穴位，針刺水溝穴可有效治療中風(fēng)。研究表明，針刺水溝可以改善腦循環(huán)，促進(jìn)建立側(cè)支循環(huán)，并能抑制腦神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[8-9]。針刺大腦中動脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion model，MCAO）大鼠水溝穴，可以下調(diào)蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）水平和活性，緩解大腦中動脈平滑肌痙攣[10]。不同頻率電針刺激水溝穴具有調(diào)控大鼠血腦屏障通透性的效應(yīng)，可抑制大腦皮層毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)[11]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)水溝穴電針干預(yù)，電針組模型大鼠Calponin、Caldesmon 表達(dá)均呈上調(diào)（P＜0.05）。

PKC-δ 是一種炎癥調(diào)節(jié)因子，它可以調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）和促炎基因如白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6 表達(dá)，激活細(xì)胞因子和趨化因子的分泌[12]。Calponin、Caldesmon是存在于腦血管平滑肌中的重要收縮抑制蛋白，腦缺血時PKC 激活，Calponin、Caldesmon 磷酸化，不再抑制三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶活性，促使血管平滑肌持續(xù)收縮，進(jìn)一步導(dǎo)致缺血性腦損害[13-14]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組Calponin、Caldesmonn 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），而與模型組相比，電針組Calponin、Caldesmonn 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），表明經(jīng)過電針干預(yù)后大鼠腦血管平滑肌Calponin 和Caldesmon 蛋白表達(dá)下調(diào)延緩。

綜上所述，電針?biāo)疁涎梢砸种颇X梗死大鼠腦血管平滑肌收縮關(guān)鍵蛋白Calponin、Caldesmon 下調(diào)，推測電針?biāo)疁涎ㄍㄟ^改善腦梗死模型大鼠腦血管平滑肌收縮，從而達(dá)到治療腦梗死的作用。