二十二碳六烯酸對甲基苯丙胺誘導的人神經母細胞瘤細胞神經毒性的影響

陳芳萍，王琪，鄭丹，官志忠，樓迪棟，4

（1.貴州醫(yī)科大學法醫(yī)學院法醫(yī)病理學教研室，貴陽 550004；2.貴陽市婦幼保健院圍產期保健科，貴陽 550003；3.貴州醫(yī)科大學地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室，貴陽 550004；4.貴州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院法醫(yī)學教研室，貴陽 550025）

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）俗稱“冰毒”，能夠引起強烈的精神興奮，是一種極易成癮的新型合成毒品［1］。研究證實，METH作用于多個存在獎勵機制的大腦區(qū)域（邊緣系統(tǒng)、海馬體、伏隔核），主要通過促進單胺類神經遞質的釋放及抑制其再攝取導致成癮［2］。長期吸食METH可導致意識障礙、幻聽、幻視、抑郁等臨床癥狀，顯示了METH的神經毒性作用［3-5］。METH誘導的神經毒性主要表現(xiàn)為多種神經細胞的細胞炎癥、細胞凋亡和氧化應激。METH精神依賴性強、藥效持久且價格相對低廉，因此成為世界范圍內的主要毒品之一。而METH長期濫用導致的神經毒性及成癮性給公共健康帶來沉重負擔［6-7］。

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是一種ω-3不飽和脂肪酸，俗稱“腦黃金”，是生物膜中磷脂的重要成分，對人類神經細胞的生長及功能維持起著重要作用。DHA在機體內代謝可衍生成炎癥抑制介質消退素和保護素。消退素和保護素調控各種黏附分子和炎癥介質的表達和釋放，不僅具有強效的抗炎促消退效應，還具有神經保護作用［8］。本研究主要采用蛋白質組學方法研究并鑒定人神經母細胞瘤SH-SY5Y 細胞蛋白表達和相關信號通路的變化，探討DHA在METH誘導的神經毒性中的作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y 細胞株購自美國Sigma 公司。主要試劑包括METH（美國 Cerilliant 公司，標準品：M-009，純度99.9 %）、DHA（美國Sigma 公司）、DMEM∶F12 細胞培養(yǎng)基（美國 Gibco 公司）、annexin V-FITC 雙染凋亡試劑盒（江蘇凱基生物公司）。主要儀器包括流式細胞儀（美國 Beckman 公司）、LC-20AB液相系統(tǒng)（日本 Shimadzu公司）、UltiMate 3000液相色譜儀、Q-Exactive HF X串聯(lián)質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 ：配制含 89 % DMEM∶F12、10 % 胎牛血清、1 % 雙抗的細胞培養(yǎng)液，1～2 d換液 1 次，取對數(shù)生長期的細胞進行傳代。根據(jù)前期實驗［9］結果，設置METH的作用濃度為2.0 mmol·L-1，作用時間為24 h，將同時段培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y 細胞分為METH（2.0 mmol·L-1）組、METH（2.0 mmol·L-1）+DHA（50 μmol·L-1）組、Control組（不含METH與DHA）［10-11］。用相應的含METH和DHA的培養(yǎng)基處理各組細胞，37 ℃、5 % CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 Tandem Mass Tags（TMT）標記定量蛋白組學：收集每個樣本中的細胞液，加入終濃度10 mmol·L-1的二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），利用超聲儀破碎裂解，4 ℃ 25 000g離心15 min，取上清。上清中加入終濃度55 mmol·L-1的碘代乙酰胺（iodoacetamide，IAA），暗室放置45 min。4 ℃ 25 000g離心15 min，取上清得到蛋白液。將蛋白溶液加入Trypsin酶，渦旋振蕩后，低速離心1 min，37 ℃孵育2 h。

將酶切并除鹽后的肽段與TMT溶液（0.8 mg）快速混合均勻，震蕩離心，室溫放置2 h；使用LC-20AB液相系統(tǒng)，對樣品進行液相分離。經過液相分離的肽段通過nanoESI源離子化后進入串聯(lián)質譜儀Q-Exactive HF X進行Data-dependent Acquisition（DDA）模式檢測。

1.2.3 生物信息學分析：在Mascot Percolator算法的基礎上對標記的多肽與同位素標簽進行定量分析，使FDR≤0.01。蛋白質相互作用網(wǎng)絡應用STRING（https：//string-db.org）進行分析，置信度為0.7。

1.2.4 形態(tài)學觀察與細胞長短軸比值計算：顯微鏡下觀察SH-SY5Y的形態(tài)，記錄各組圖像；測量各組細胞的長軸與短軸，計算比值［12］。

1.2.5 SH-SY5Y細胞凋亡水平檢測：用不含乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化培養(yǎng)板中的細胞 1 min，溫和吹打并收集，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）漂洗 3 次后懸浮于結合緩沖液中，加入 annexin V-FITC/PI 雙染料，避光染色 15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用 SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DHA可改善METH引起的SH-SY5Y細胞形態(tài)學變化

結果顯示，Control組SH-SY5Y細胞呈長梭形，具有較長的神經突。METH組SH-SY5Y細胞神經突縮短，胞體萎縮，呈圓形；METH+DHA組SH-SY5Y細胞神經突皺縮情況有所改善，見圖1。不同組SH-SY5Y細胞長軸與短軸比值的分析結果顯示，METH組（1.48±0.09）較對照組（3.16±0.17）減小（P＜0.05），METH+DHA組（2.09±0.13）較METH組增大（P＜0.05）。

圖1 各組SH-SY5Y細胞形態(tài)學比較 ×200Fig.1 Comparison of the morphology of SH-SY5Y cells in each group ×200

2.2 DHA緩解METH誘導的SH-SY5Y細胞凋亡

流式細胞術結果顯示，與對照組［Q2：（0.91±0.23）%；Q3：（3.09±0.32）%］比較，METH組［Q2：（3.24±0.27）%；Q3：（5.72±0.74）%］早期凋亡細胞（Q3）和晚期凋亡細胞（Q2）比例升高，且總凋亡細胞（Q2+Q3）與對照組［（4.01±0.53）% ］比較，METH組［（8.96±0.60）%］比例也明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與METH組比較，METH+DHA組晚期凋亡細胞［（1.53±0.20）%］和總凋亡細胞 ［（5.63±0.51）%］細胞比例降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而早期凋亡細胞［（4.10±0.52）%］比例改變沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但仍表現(xiàn)出了降低的趨勢，見圖2?？梢奙ETH具有神經毒性作用，同時也表明DHA對經METH處理的SH-SY5Y細胞具有神經保護作用。

圖2 流式細胞術分析SH-SY5Y細胞凋亡Fig.2 Analysis of apoptosis in SH-SY5Y cells by flow cytometry

2.3 差異表達蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）分析

定量質譜共檢測到的767 173個肽段，以1%為標準的肽段匹配率（peptide-spectrum matches，PSM）和假陽性率（false discovery rate，F(xiàn)DR）判斷，共識別出6 543個蛋白。以倍數(shù)變化＞1.200視為上調蛋白，倍數(shù)變化＜0.833視為下調蛋白。與對照組比較，METH組蛋白譜發(fā)生了顯著變化，上調蛋白1 249個（19.09%），下調蛋 白1 503個（22.97%）。在METH+DHA組和對照組的比較中，共識別出2 754個DEPs，其中1 243個上調，1 511個下調。在METH+DHA組和METH組的比較中，共識別出70個DEPs，其中36個上調，34個下調，見圖3。

圖3 Control組、METH組和METH+DHA組的蛋白全譜比較Fig.3 Comparison of the protein profiles in the Control，METH，and METH+DHA groups

2.4 DHA反向調節(jié)METH誘導的DEPs（圖4）

圖4 DEPs的聯(lián)合分析Fig.4 Combination analysis for DEPs

為進一步了解DHA對METH神經毒性的緩解作用，在METH組與對照組相比得到的DEPs和METH+DHA組與METH組相比得到的DEPs基礎上，篩選出兩者間調控相反的DEPs。如圖4所示，有7個蛋白既在METH組與對照組比較中上調，又在METH+DHA組與METH組比較中下調；METH組與對照組比較中15個下調蛋白在METH+DHA組與METH組中重新上調。提示此22個反向調節(jié)的蛋白可能與DHA緩解METH神經毒性有關。對此22個反向調節(jié)蛋白進行相互作用的網(wǎng)絡分析結果顯示，11個蛋白存在相互作用，其作用分別涉及細胞骨架、核糖體以及谷胱甘肽代謝，見圖5。

圖5 反向調節(jié)蛋白的互作網(wǎng)絡構建Fig.5 Interaction network of the reversely regulated proteins

3 討論

本研究從形態(tài)學和細胞凋亡的角度揭示了DHA可緩解METH引起的神經毒性，并運用蛋白質組學技術發(fā)現(xiàn)了METH引起的SH-SY5Y蛋白全譜的變化，揭示了DHA在METH神經毒性作用方面的潛在有效靶點。

研究［13-15］發(fā)現(xiàn)METH可誘導神經元和內皮細胞的骨架重排，可能誘發(fā)神經結構的改變和血腦屏障的破壞。此外，在METH的誘導下，大鼠C6星形膠質細胞也呈現(xiàn)為圓形。本研究結果顯示，加入METH后，鏡下可見SH-SY5Y細胞質突起明顯縮短，趨向于圓形，提示METH可引起神經細胞的形態(tài)變化，與以往研究［16］結果一致。另一方面已有研究顯示，反復暴露于METH可導致紋狀體多巴胺能軸突末梢發(fā)生神經退行性病變［17］。在METH作用下小膠質細胞也經歷由C/EBP-β活化誘導的凋亡過程［18-19］。本研究中流式細胞術顯示了METH顯著增加了早期凋亡和晚期凋亡細胞比例，說明了其誘導神經細胞凋亡的神經毒性作用。

DHA是大腦中主要的ω-3多不飽和脂肪酸，由于其獨特的神經保護和抗炎特性而備受關注。研究［20］表明，DHA可增加靶標微管蛋白的表達，而微管蛋白是細胞骨架的結構單位。本研究觀察到DHA增加了SH-SY5Y細胞神經突的長度，同時使6種角蛋白的表達重新上調。角蛋白作為保持細胞形態(tài)穩(wěn)定的基本單位，可能是DHA緩解METH神經毒性的作用靶標。谷胱甘肽通過其還原性巰基具有抗氧化和解毒作用。研究［21］表明，DHA增加總谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）活性，對于H2O2誘導的氧化應激、凋亡具有保護作用。GPX蛋白家族，尤其是GPX1和GPX4，主要功能是清除H2O2和減少過氧化物的生成，對神經元的活性和功能至關重要［22-23］。本研究結果顯示METH降低了SH-SY5Y細胞中GPX4的表達，加入DHA可以顯著回調其表達，并緩解神經細胞凋亡，表明DHA可能通過調節(jié)GPX4，進一步改善谷胱甘肽代謝，進而緩解METH引起的神經細胞凋亡。

綜上所述，DHA可以緩解METH引起的SH-SY5Y細胞的形態(tài)及功能的改變，其機制可能與調控角蛋白和GPX4等信號通路密切相關。本研究為戒毒治療藥物研發(fā)奠定了基礎。然而定量蛋白組學只能宏觀檢測蛋白質量的變化，并不能反應出具體功能的改變，因此，DHA減弱METH誘導的神經毒性作用的具體機制仍需進一步闡明。