WWP2在急性淋巴細胞白血病細胞系中的表達及其對多柔比星藥物敏感性的影響

徐海琪，黃心悅，張麗君

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，沈陽 110001）

含有E3泛素蛋白連接酶2的WW結構域（recombinant WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，WWP2）是編碼Nedd4家族成員中一種重要的E3連接酶［1-3］。WWP2參與包括膜蛋白轉運、蛋白質降解、信號轉導以及轉錄凋亡等多種細胞過程，并與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關［4］。急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是血液系統(tǒng)的一種異質性惡性腫瘤，預后較差，其病因和發(fā)病機制目前尚不明確。本研究擬觀察WWP2對ALL細胞系生物學行為的可能的影響，旨在探討該基因對ALL發(fā)生發(fā)展的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料

ALL細胞系Jurkat來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液研究室。RPMI-1640及PBS購自美國Gibco公司；polybrene、兩性霉素B及嘌呤霉素購自日本Sigma公司；Higene購自中國普利萊公司；質粒購自中國吉凱公司；多柔比星（doxorubicin，dox）購自美國輝瑞制藥有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司；細胞凋亡試劑盒及組織活性氧購自中國碧云天生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃孵箱中培養(yǎng)Jurkat細胞。細胞傳代3次后行臺盼藍染色，應用細胞計數(shù)儀計數(shù)細胞，存活率≥97%即可進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞轉染：用PBS清洗細胞，接種至6孔板中（密度60%～70%），更換含polybrene（6 μg/mL）的培養(yǎng)基。分別加入60 μL含WWP2shRNA及空載的病毒液孵育，48 h后再滴加60 μL，48 h后更換培養(yǎng)瓶，補5～10 mL培養(yǎng)液，觀察細胞生長情況。轉染結束后，向培養(yǎng)基中加入10 μg/mL嘌呤霉素進行陽性篩選。將1 mL 0.9% NaCl、24 μL轉染試劑、HA質粒15 μL、WWP2質粒20 μL混勻后，室溫靜置20 min，加入細胞培養(yǎng)基中，36～48 h后觀察細胞形態(tài)，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 CCK-8實驗：將轉染后Jurkat細胞（3.0×105/mL）接種于96孔板中，100 μL/孔。設置空白孔，設置不同濃度（0、0.05、0.1、0.2、0.4 μmol/mL）dox藥物處理組，每組4個復孔，孵育6 h，加入CCK-8試劑10 μL/孔，繼續(xù)孵育1 h后，用酶標儀檢測樣品450 nm處OD值。

1.2.4 流式細胞術：將經(jīng)過0.2 μmol/mL dox處理的細胞重懸于500 μL binding buffer中，分別加入細胞3 μL FITC和1 μL PI染料，混勻，同時設置3管FITC-/PI-、FITC+/PI-、FITC-/PI+，避光靜置10～15 min，應用流式細胞儀檢測。

1.2.5 活性氧檢測：用無血清RPMI-1640稀釋（1∶1 000）活性氧熒光探針（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）至終濃度10 μmol/L。收集細胞，與DCFH-DA充分接觸，于37 ℃孵育30 min，每隔3～5 min顛倒混勻1次，用RPMI-1640洗滌細胞3次，充分去除未進入細胞的DCFH-DA。利用甩片機將細胞甩至載玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0和Graphpad prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。采用秩和檢驗的非參數(shù)檢驗方式分析，兩變量相關程度采用雙變量相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 WWP2表達水平與細胞增殖活性

分別用0、0.05、0.1、0.2、0.4 μmol/mL的dox刺激細胞48 h，通過CCK-8實驗探討WWP2對Jurkat細胞增殖活性的影響。結果表明，與未敲減的對照組相比，敲減WWP2后，細胞增殖活性明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而過表達WWP2后，細胞增殖活性則明顯升高（P＜0.01），見圖1。當dox濃度為0.2 μmol/mL時，細胞增殖活性約為50%，因此選擇該藥物濃度進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度dox刺激下各組細胞增殖能力的比較Fig.1 Comparison of cells proliferation under different concentrations of dox between different groups

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

流式細胞術結果顯示，加入dox后，敲減WWP2組細胞凋亡率較對照組明顯增高（P＜0.01），而過表達WWP2基因組細胞凋亡率較對照組明顯降低（P＜0.01），見圖2。提示W(wǎng)WP2基因可能作為癌基因抑制Jurkat細胞的凋亡。未經(jīng)dox處理的各組細胞凋亡率無顯著差異，WWP2低表達的細胞對dox更敏感，而WWP2表達水平較高的細胞對dox不敏感，因此，推測dox對細胞的損傷作用可能部分受WWP2基因調(diào)控。

圖2 流式細胞技術檢測各組Jurkat細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis analysis of Jurkat cells by flow cytometry

2.3 細胞中活性氧檢測結果

熒光顯微鏡下可見，與對照組相比，加入0.2 μmol/mL dox后，敲減WWP2組細胞更亮，細胞數(shù)相對更少（圖3A），而過表達WWP2組細胞更暗，細胞數(shù)相對更多（圖3B）。間接證明，敲減WWP2的Jurkat細胞產(chǎn)生的活性氧物質增多，而過表達WWP2的Jurkat細胞產(chǎn)生活性氧物質減少；dox對敲減WWP2的Jurkat細胞抑制作用明顯增強，對過表達WWP2的細胞抑制作用則減弱。

3 討論

WWP2基因位于染色體16q21.1，可在人類心臟、腦、肝臟、胰腺、肺及腎臟等器官表達。WWP2參與多種細胞過程，并與腫瘤相關底物結合，與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關［4］。FUKUMOTO等［5］發(fā)現(xiàn)，在人口腔鱗狀細胞癌細胞系中WWP2mRNA表達上調(diào)，蛋白表達顯著增加；敲除WWP2基因可抑制細胞增殖能力，但對遷移能力則無顯著影響。研究［6-10］表明，WWP2在多種實體腫瘤中表達水平上調(diào)，發(fā)揮癌基因的作用。有學者研究了WWP2與淋巴瘤的關系，發(fā)現(xiàn)該基因可作為生物標志物鑒別反應性濾泡增生和濾泡性淋巴瘤。文獻［11-12］報道，日本蟾蜍毒治療對多發(fā)性骨髓瘤誘導的骨溶解具有抑制作用。

ALL是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，以未成熟的淋巴樣細胞分化和增殖受損為主，發(fā)生于骨髓、外周血或某些髓外組織中［13］。ALL多發(fā)病于2～5歲或50歲后［14］。近年來，兒童ALL治愈率明顯提高，而成人ALL預后遠不如小兒［15］，長期無病生存率僅為35%～45%［16-17］。ALL預后較差，治愈率僅為20%～40%［18］。WWP2在多種實體腫瘤中均發(fā)揮癌基因的作用［7-10］，而它在血液系統(tǒng)，尤其是ALL中的作用機制尚未明確。本研究首次探討了WWP2在ALL中的作用，通過細胞增殖實驗、流式細胞術以及活性氧染色等方法觀察了WWP2基因對ALL細胞系Jurkat的生物學行為的影響。結果顯示，敲減WWP2基因使Jurkat細胞增殖活性降低，細胞凋亡增多，產(chǎn)生活性氧減少，而過表達WWP2產(chǎn)生的作用則相反。本研究還發(fā)現(xiàn)，WWP2基因敲減的細胞對dox更加敏感，而WWP2過表達的細胞對dox的敏感性則明顯降低。這意味著對WWP2低表達的患者應用dox藥物治療可能產(chǎn)生良好的效果，但WWP2高表達的患者則應考慮選擇其他合適的藥物進行治療。因此，臨床上可以對所有ALL初治患者進行WWP2表達水平檢測，其結果將會為ALL疾病的治療及預后提供依據(jù)。另外，WWP2也許可作為指導ALL患者的治療及預后的靶基因，為相關靶向藥物研究及復發(fā)難治患者的治療提供新的思路。

綜上所述，本研究首次證明了WWP2基因可能是ALL新的潛在癌基因，有望為疾病診斷、治療和預測預后提供新的靶點。此外，對WWP2低表達的患者，dox是一種很有效的藥物，而對WWP2高表達的患者應慎重選擇其他合適的化療藥物。