豚草粗提物提取及對(duì)楊樹爛皮病抑菌效果比較

紀(jì)純陽

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115213)

豚草Ambrosiaartemisiifolia又名艾葉破布草，屬菊科、豚草屬，1年生草本植物。它被列為世界公認(rèn)的危害性雜草，在我國(guó)各地均有分布[1]。許多學(xué)者對(duì)豚草進(jìn)行了各方面研究，主要包括形態(tài)學(xué)、分類學(xué)、生理生態(tài)學(xué)、種群生態(tài)學(xué)等[2]。其含有豐富的倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有化感、殺蟲抑菌、滅螺等多種生物活性[3-4]。

楊樹爛皮病又稱腐爛病，病原有性階段為污黑腐皮殼菌Valsasordida，無性階段為金黃殼囊孢菌Cytosporachrysosperma[5]。楊樹爛皮病是危害嚴(yán)重的枝干病害，是潛伏侵染性病害，通常分為干腐型和枝枯型。當(dāng)遇到凍害、水澇、干旱及日灼等惡劣環(huán)境，或者受移植苗木或修剪強(qiáng)度大等因素影響時(shí)，樹木不易恢復(fù)生機(jī)而導(dǎo)致病害迅速發(fā)生，輕度會(huì)影響到樹木生長(zhǎng)，出現(xiàn)枯枝、枯干、放葉晚、葉片變小等病狀，嚴(yán)重時(shí)造成樹木大面積死亡[5-6]。楊樹病害的防治常采用化學(xué)農(nóng)藥，而傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥存在污染環(huán)境和產(chǎn)生抗藥性等問題，人們?cè)絹碓絻A向于從天然物質(zhì)中尋找更安全、更高效的活性物質(zhì)以開發(fā)新型農(nóng)藥。從植物中尋找抑菌活性物質(zhì)是開發(fā)、研制無公害新型抑菌劑的重要途徑之一[7]。

豚草作為一種新型植物源農(nóng)藥的植物資源，在農(nóng)林漁業(yè)有一定的應(yīng)用，但如何從豚草的葉片中提取抑菌活性物質(zhì)是應(yīng)用的前提條件。本文研究了豚草粗提物的提取工藝及對(duì)楊樹爛皮病林間防治效果比較，這在省內(nèi)未見報(bào)道，以期為新型植物源農(nóng)藥的研究提供前期的基礎(chǔ)，為推進(jìn)植物源農(nóng)藥在林木病蟲害防治中的應(yīng)用與推廣提供依據(jù)。

1 供試材料

1.1 試驗(yàn)材料

豚草Ambrosiaartemisiifolia，采自遼寧省蓋州市高麗城和西海等地區(qū)。

試驗(yàn)地設(shè)在國(guó)有新民機(jī)械化林場(chǎng)，4年生108楊栽植密度2.5 m×5 m，自然發(fā)生楊樹爛皮病。

1.2 供試藥劑

50%多菌靈(江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司)，3%甲基硫菌靈(山西北方果康寶農(nóng)藥有限公司)，果緣高(山西省農(nóng)科院棉花所三聯(lián)農(nóng)化實(shí)驗(yàn)廠)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 豚草葉片的預(yù)處理

將采集的豚草葉片用清水洗凈，放于通風(fēng)陰涼處陰干，再用50 ℃烘箱烘干至恒重后，用中藥材粉碎機(jī)粉碎1 min，稱重分裝于棕色試劑瓶中，放于陰涼處保存?zhèn)溆肹8-9]。

2.2 豚草粗提物提取方法

選取了冷浸、溫浸、索氏、超聲波、冷浸-超聲波聯(lián)合和溫浸-超聲波聯(lián)合6種提取方法提取豚草粗提物[10-15]。

2.2.1 冷浸法

稱取豚草粉末10 g裝入250 mL燒杯內(nèi)，加入80%乙醇溶液200 mL，用保鮮膜將燒杯口密封，室溫浸泡24 h，并攪拌3～4次。

2.2.2 溫浸法

稱取豚草粉末10 g裝入250 mL的燒杯內(nèi)，加入80%乙醇溶液200 mL，用保鮮膜將燒杯口密封好，放在恒溫水浴鍋(40 ℃)24 h，并攪拌3～4次。

2.2.3 索氏提取法

稱取豚草粉末10 g，用濾紙包成封閉小包，務(wù)必封好口不讓粉末漏出，將小包置于索氏提取器中，加入80%乙醇200 mL，90 ℃水浴加熱約10 h，讓小紙包完全浸透，發(fā)生虹吸現(xiàn)象后，停止提取。

2.2.4 超聲波提取法

稱取豚草粉末10 g裝入250 mL錐形瓶中，加入80%的乙醇溶液200 mL，用保鮮膜和橡皮筋密封，置于超聲波振蕩50 min，并攪拌2次。

2.2.5 冷浸-超聲聯(lián)合提取法

稱取豚草粉末10 g裝入250 mL錐形瓶中，加入80%乙醇溶液200 mL，用保鮮膜和橡皮筋密封，室溫放置2 h后超聲波振蕩50 min，再室溫放置22 h，并攪拌3～4次。

2.2.6 溫浸-超聲聯(lián)合提取法

稱取豚草粉末10 g置于250 mL錐形瓶中，加入80%乙醇200 mL，用保鮮膜和橡皮筋密封，40 ℃水浴2 h后超聲波振蕩50 min，之后再水浴22 h，并攪拌3～4次。

2.2.7 提取物的析出

以上6種提取方法設(shè)置3次重復(fù)，各組提取液經(jīng)真空抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(40 ℃，80～120 r·min-1)減壓濃縮至無溶劑滴出，即得膏狀粗提物，再將其轉(zhuǎn)移至小燒杯或平皿中，必要時(shí)可使用10%的吐溫溶液助溶，于40 ℃烘箱中烘干稱重，放入4 ℃冰箱中保存[16]。計(jì)算提取率，確定最佳的提取方法。

2.3 豚草粗提物提取條件的優(yōu)化

對(duì)最佳提取方法中的提取條件因子進(jìn)行優(yōu)化，選擇4因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，設(shè)置3次重復(fù)。各組提取液經(jīng)真空抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(40 ℃，80～120 r·min-1)減壓濃縮至無溶劑滴出，即得膏狀粗提物，再將其轉(zhuǎn)移至小燒杯或平皿中，必要時(shí)可使用10%的吐溫溶液助溶，于40 ℃烘箱中烘干稱重，計(jì)算提取率，確定最優(yōu)的提取條件[17-19]。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

2.4 豚草粗提物對(duì)楊樹爛皮病的林間防治試驗(yàn)

遼寧省新民市國(guó)有機(jī)械化林場(chǎng)4年生108楊，自然發(fā)生楊樹爛皮病。共選擇4種藥劑，豚草提取物(40 mg·mL-1)、果緣高(原液)、多菌靈(500倍稀釋液)、甲基硫菌靈(5倍稀釋液)，對(duì)4年生108楊楊樹爛皮病進(jìn)行了林間防治試驗(yàn)。因病斑面積大，采用刮皮后涂抹和直接涂抹2種方法進(jìn)行防治，選取3個(gè)連續(xù)區(qū)域(3次重復(fù))，隔7 d再涂抹1次，40 d后進(jìn)行病害調(diào)查。根據(jù)爛皮病病斑是否外擴(kuò)統(tǒng)計(jì)病害防治情況[20-21]。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用DPS18.10高級(jí)版軟件LSD法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算粗提物提取率和林間防治病株減退率[22-23]。公式如下：

3 結(jié)果與分析

3.1 豚草粗提物提取方法

選取冷浸、溫浸、索氏、超聲波、冷浸-超聲波聯(lián)合及溫浸-超聲波聯(lián)合6種提取方法提取豚草中抑菌活性物質(zhì)，以提取物干重為測(cè)量指標(biāo)，計(jì)算提取率。6種提取方法提取率依次為：溫浸-超聲波法(18.93%)>冷浸-超聲波法(17.14%)>超聲波法(16.99%)>索氏法(16.93%)>溫浸法(15.25%)>冷浸法(14.10%)，溫浸-超聲波法除了與冷浸-超聲波法差異不顯著外，與其它4種提取方法存在顯著性差異(P<0.05)。因此豚草粗提物最佳提取方法為溫浸-超聲聯(lián)合提取法，提取率達(dá)到18.93%。

3.2 豚草提取物提取條件的優(yōu)化

選擇溫浸-超聲波聯(lián)合法提取豚草粗提物，對(duì)提取過程中影響顯著的4個(gè)因素各選3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 豚草粗提物提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果

通過正交試驗(yàn)確定最佳的提取條件為第5組A2B2C3D1組合，即超聲波時(shí)間45 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%、料液比1∶20 g·mL-1、40 ℃水浴24 h。其中超聲波時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)兩個(gè)因素對(duì)豚草粗提物的提取率影響顯著。在最佳提取工藝下，豚草粗提物的提取率達(dá)到20.35%。

3.3 豚草粗提物與3種藥劑對(duì)楊樹爛皮病的林間防治效果

從表3可以看出，刮皮后涂藥處理的病株減退率依次是豚草粗提物>多菌靈>果緣高>甲基硫菌靈，直接涂抹病株減退率依次是多菌靈>豚草粗提物>甲基硫菌靈>果緣高，由此可見刮皮后涂藥處理比直接涂抹防治效果更佳，豚草粗提物與多菌靈的防治效果優(yōu)于其他2種藥劑，說明豚草粗提物對(duì)楊樹爛皮病有較好的防治作用。

表3 四種藥劑對(duì)楊樹爛皮病的林間防治試驗(yàn)效果比較

4 結(jié)論與討論

本文對(duì)豚草粗提物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過試驗(yàn)確定了最佳的提取方法為溫浸-超聲波聯(lián)合提取法，提取條件為超聲波45 min、75%乙醇溶液、料液比1∶20 g·mL-1、40 ℃水浴24 h，提取率為20.35%。

為了更好地將豚草提取物質(zhì)應(yīng)用于林業(yè)病害的防治中，開展了豚草粗提物與3種藥劑對(duì)楊樹爛皮病的林間防治效果比較試驗(yàn)。采用刮皮后涂抹防治效果更佳，豚草粗提物與多菌靈的防治效果優(yōu)于其他2種藥劑，證實(shí)豚草粗提物對(duì)楊樹爛皮病有較好的防治作用。本項(xiàng)研究在豚草粗提物林間防治楊樹爛皮病方面雖然達(dá)到了一定的效果，但林間防治還存在防治藥劑的選擇、防治時(shí)間、藥劑使用量和防治效果統(tǒng)計(jì)分析難度大等問題，本試驗(yàn)僅開展了小樣本的林間防治，在確定試驗(yàn)效果后可再開展大規(guī)模的防治試驗(yàn)。

本研究為進(jìn)一步開發(fā)林業(yè)用植物源殺菌劑提供理論依據(jù)，為確定用于生產(chǎn)和防治工作的新型植物源農(nóng)藥提供前期研究基礎(chǔ)，使豚草這種入侵植物變廢為寶，對(duì)推進(jìn)無公害農(nóng)藥的研究和應(yīng)用有著重大的意義。