FXYD3在宮頸鱗癌患者組織中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

馬學(xué)玲，蔡海瑜，車艷紅，劉星爍

(鄭州市婦幼保健院a.婦科，b.婦科腫瘤病區(qū)，鄭州 450052)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，以宮頸鱗癌較為多發(fā)，近來發(fā)病呈年輕化趨勢，危害嚴(yán)重[1]。早期確診患者的5年生存率可達(dá)90%，但晚期多發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差，Ⅳ期患者的5年生存率不足20%[2]。宮頸癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，探究與發(fā)病機(jī)制相關(guān)的分子標(biāo)志物對宮頸癌的病情監(jiān)測具有重要意義。FXYD3蛋白(domain-containing ion transport regulator3 precursor)是FXYD蛋白質(zhì)家族成員，以脯氨酸-苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸(PFXYD)而得名，又稱為乳腺腫瘤標(biāo)志物(MAT-8)，其可通過調(diào)節(jié)Na+-K+泵，參與細(xì)胞內(nèi)環(huán)境代謝及穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XYD3在乳腺癌[3]、前列腺癌[4]等多種癌癥中的表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。然而，關(guān)于FXYD3在宮頸鱗癌中表達(dá)情況的報道少見。雖然不同腫瘤的異質(zhì)性極大的影響了相關(guān)腫瘤分子標(biāo)志物的表達(dá)、患者治療、預(yù)后及復(fù)發(fā)等，但不同腫瘤之間亦存在相似性，研究腫瘤異質(zhì)性及相似性可加深對腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的認(rèn)知[5]。因此，本研究選取FXYD3基因為研究對象，通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫及免疫組化染色法分析FXYD3在正常宮頸組織及宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況，并初步探討其與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2015年9月至2018年1月于鄭州市婦幼保健院婦科收治的65例宮頸鱗癌患者癌組織標(biāo)本，年齡(46.92±10.35)歲，腫瘤臨床(FIGO)分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期32例，Ⅲ期13例，Ⅳ期5例；病理分級：Ⅰ級12例，Ⅱ級39例，Ⅲ級14例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例，未轉(zhuǎn)移者39例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)宮頸鱗癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)均行手術(shù)切除，術(shù)前均未進(jìn)行放化療等抗腫瘤治療，術(shù)后均經(jīng)組織病理學(xué)證實為宮頸鱗癌；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)合并基礎(chǔ)性疾病或慢性感染性疾病者。另取同期50例本院保存的因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的正常宮頸組織標(biāo)本作為對照組，年齡(46.41±11.08)歲，均經(jīng)超聲和病理檢查確診為子宮肌瘤[7]。本研究通過鄭州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)[倫理批文：2015-(倫)009)]?；颊叱鲈汉笸ㄟ^門診復(fù)查、電話等方式對患者進(jìn)行隨訪，記錄患者生存時間(overall survival，OS)。本次隨訪截止日期為2020年12月。

1.2儀器與試劑 NanoDrop 2000c 超微量紫外分光光度計、905-ULT超低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司)，CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。RNA提取試劑盒(北京天根公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，兔抗人FXYD3多克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(英國Abcam公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.3方法

1.3.1數(shù)據(jù)庫挖掘分析 使用TCGA門戶網(wǎng)站的UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)深入分析31種癌癥類型的RNA測序數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://www.cancer.gov)下載宮頸鱗癌對應(yīng)的mRNA表達(dá)RNASeq數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析來自TCGA和GTEX數(shù)據(jù)庫中樣本的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)。下載GTEX數(shù)據(jù)庫(https://commonfund.nih.gov/gtex)中正常宮頸組織的RNA Seq數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)，基于以上2種數(shù)據(jù)庫，篩選存在FXYD3mRNA表達(dá)的宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織樣本，分析FXYD3在宮頸鱗癌(CESC)組織及正常宮頸組織中的表達(dá)差異。

1.3.2RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照RNA提取試劑盒說明書對宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織標(biāo)本(各60 mg)中的總RNA進(jìn)行提取。NanoDrop 2000c 分光光度計檢測RNA濃度，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值在1.8～2.0間的樣本，置于-80 ℃保存。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃保存。

1.3.3引物設(shè)計及實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 參照GenBank中各基因的序列號(FXYD3序列號為NC_000019.10、GAPDH序列號為NC_000012.12)，引物設(shè)計參照文獻(xiàn)[8]，并由上海生工公司合成。FXYD3上游引物序列:5′-CCTGTCCTGGACGCCAAT-3′，下游引物序列:5′-GAGGCTGTGCCAGTCATAGTAGAA-3′，退火溫度61 ℃，產(chǎn)物片段大小243 bp；GAPDH上游引物序列:5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物序列:5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。qRT-PCR反應(yīng)體系共25 μL，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，滅菌水8.5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35個循環(huán);72 ℃時采集熒光信號。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計算FXYD3mRNA的相對表達(dá)量，計算公式：ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct內(nèi)參基因)-(對照Ct目的基因-對照Ct內(nèi)參基因)]。

1.3.4免疫組化染色法檢測FXYD3蛋白表達(dá) 石蠟組織切片標(biāo)本常規(guī)脫蠟至水，修復(fù)抗原，加入6%的正常山羊血清室溫封閉30 min，加入50 μL兔抗人FXYD3多克隆抗體(1∶100稀釋)4 ℃過夜，PBS洗滌3次，加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀釋)，37 ℃溫育1 h，PBS洗滌3次，DAB染色5 min，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精短暫分化后，脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定:由2名資深病理醫(yī)師采用雙盲法分別對染色結(jié)果進(jìn)行半定量評分。細(xì)胞質(zhì)或核內(nèi)呈黃色或棕色顆粒為陽性染色，采用免疫反應(yīng)積分(IRS)法進(jìn)行評分：染色強(qiáng)度(SI)積分，無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性染色細(xì)胞百分比(PP)積分，陰性記0分，PP 1%～10%記1分，PP 11%～50%記2分，PP 51%～75%記3分，PP 76%～100%記4分。IRS = SI積分×PP積分，IRS≥3為陽性，IRS<3為陰性。

1.3.5FXYD3共表達(dá)基因分析 基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫(https://www.cbioportal.org/)，選取相關(guān)系數(shù)r>0.3且P<0.05的基因。進(jìn)一步將其導(dǎo)入Enrichr網(wǎng)站(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr)進(jìn)行共表達(dá)基因的富集分析，選擇顯著相關(guān)通路，采用ImageGP(http://www.ehbio.com/Cloud_Platform/front/)在線軟件進(jìn)行信號通路富集分析，以氣泡圖形式呈現(xiàn)富集結(jié)果。

1.3.6FXYD3蛋白互作分析 STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)是一種用于識別已知蛋白質(zhì)和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的軟件系統(tǒng)?；赟TRING數(shù)據(jù)庫對FXYD3蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析，繪制蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1FXYD3在宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織中的表達(dá)差異 UALCAN數(shù)據(jù)庫中共分析了3例正常宮頸組織及305例宮頸鱗癌組織中FXYD3的表達(dá)，結(jié)果顯示宮頸鱗癌組織中FXYD3的表達(dá)水平[8.921(8.287，9.400)]顯著高于正常宮頸組織[0.995(0.346，5.837)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-0.205，P<0.05)。進(jìn)一步比較GEPIA數(shù)據(jù)庫中13例正常宮頸組織[3.269(2.720，7.820)]及306例宮頸鱗癌組織[10.244(9.569，10.749)]FXYD3的表達(dá)量，結(jié)果顯示宮頸鱗癌組織中FXYD3的表達(dá)水平亦顯著高于正常宮頸組織(Z=-6.107，P<0.05)。

2.2FXYD3mRNA在宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織中的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)XYD3mRNA在50例正常宮頸組織中的表達(dá)量為1.00±0.00，在65例宮頸鱗癌組織中的表達(dá)量為1.68±0.32，F(xiàn)XYD3mRNA在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)量顯著高于正常宮頸組織(t=15.011，P<0.05)。

2.3FXYD3蛋白在宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織中的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果顯示，F(xiàn)XYD3蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)或(和)細(xì)胞膜上。宮頸鱗癌組織中FXYD3陽性表達(dá)率為63.08%(41/65)，顯著高于正常宮頸組織的28.00%(14/50)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=13.935，P<0.05)。

2.4FXYD3表達(dá)與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 基于UALCAN數(shù)據(jù)庫分析FXYD3與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示FXYD3在不同組織類型中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1E)，在不同年齡、體重、種族、癌癥分期、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移類型中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖1A～F)。本研究基于選取病例中FXYD3的表達(dá)情況，分析其與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示FXYD3蛋白的表達(dá)與年齡、病理分級均無關(guān)(P>0.05)，而與組織類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

注：A，不同年齡；B，不同體重；C，不同種族；D，不同癌癥分期；E，不同組織類型；F，不同腫瘤分級；G，不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

表1 FXYD3表達(dá)與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

2.5FXYD3蛋白表達(dá)與宮頸鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系 FXYD3蛋白陽性表達(dá)患者的平均生存時間(OS)顯著低于陰性表達(dá)患者(38.12個月 vs 53.56個月，χ2=5.485，P=0.019)。

2.6FXYD3蛋白互作共表達(dá)分析 通過STRING網(wǎng)站在線繪制FXYD3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)相關(guān)性評分分析結(jié)果顯示，相關(guān)性較強(qiáng)的前5個蛋白質(zhì)分別為ATP1B1、ATP1B2、ATP1B3、ATP1A1、ATP1A2(圖2)。

圖2 FXYD3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.7FXYD3共表達(dá)基因通路富集分析 通過cBioPortal數(shù)據(jù)庫，預(yù)測分析出417個與FXYD3共表達(dá)基因，表2為與FXYD3基因相關(guān)性較強(qiáng)的前5個基因。將共表達(dá)基因輸入Enrichr網(wǎng)站進(jìn)行通路富集分析，選擇有顯著差異的前20條，采用ImageGP在線網(wǎng)站繪制氣泡圖(圖3)，結(jié)果顯示，F(xiàn)XYD3共表達(dá)基因富集到的主要通路包括T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體、白細(xì)胞介素-17、趨化因子信號通路，氧化應(yīng)激信號通路，非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌等癌癥信號通路，蛋白質(zhì)水解、核黃素代謝、核酸合成代謝等信號通路。

表2 FXYD3基因共表達(dá)分析基因

注：氣泡大小代表基因數(shù)量，氣泡顏色由紅色至藍(lán)色表示顯著性差異的P值逐漸減小。

3 討論

FXYD3定位于人類染色體19q13.11-q13.12，是最早在家鼠的乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)的一種分子量(Mr)為8 000的單跨膜蛋白質(zhì)，其可通過調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶改變其對Na+、K+的親和力，進(jìn)而確保機(jī)體正常組織功能的運轉(zhuǎn)[9]。本研究首先采用數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計分析FXYD3基因在正常宮頸組織及宮頸鱗癌組織中的差異表達(dá)情況，UALCAN數(shù)據(jù)庫、GEPIA數(shù)據(jù)庫中的統(tǒng)計結(jié)果均顯示，宮頸鱗癌組織中FXYD3基因的表達(dá)水平顯著高于正常宮頸組織，提示FXYD3基因可能起促癌基因作用。為進(jìn)一步驗證數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計結(jié)果，本研究采用qRT-PCR和免疫組化染色法檢測65例宮頸鱗癌組織標(biāo)本及50例正常宮頸組織標(biāo)本中FXYD3mRNA及FXYD3蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示FXYD3mRNA在宮頸鱗癌組織中的相對表達(dá)量及FXYD3蛋白陽性表達(dá)率均顯著高于正常宮頸組織，與UALCAN、GEPIA數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計結(jié)果一致，提示FXYD3表達(dá)可能與宮頸鱗癌發(fā)生有關(guān)。

研究報道，F(xiàn)XYD3在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)上調(diào)是子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展的早期事件，與年齡、血壓、血糖和血脂水平、癌癥家族史、絕經(jīng)年齡、FIGO分期、組織病理學(xué)類型、組織學(xué)分級、肌層侵犯、宮頸受累度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生長方式無關(guān)，僅與生育頻率呈負(fù)相關(guān)[10]。本研究基于UALCAN數(shù)據(jù)庫分析FXYD3與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示FXYD3在不同腫瘤組織類型中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在不同年齡、體重、種族、癌癥分期、腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移類型中的表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，與Li等[10]研究結(jié)果具有相似性，但在腫瘤組織類型方面有所不同，需繼續(xù)深入探討。另有研究報道[11]，F(xiàn)XYD3在宮頸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)上調(diào)，且與LINC01503通過競爭性結(jié)合miR-342-3p正向調(diào)控FXYD3的表達(dá)機(jī)制有關(guān)，抑制FXYD3表達(dá)可抑制宮頸癌Hela、CaSki細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。本研究通過收集臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XYD3陽性表達(dá)與年齡、腫瘤分級無關(guān)，而與組織類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與Peng等[11]研究結(jié)果類似，提示FXYD3陽性表達(dá)可能與宮頸鱗癌發(fā)生及病情程度有關(guān)。筆者進(jìn)一步行生存分析結(jié)果表明，F(xiàn)XYD3陽性表達(dá)患者具有更短的生存時間，提示FXYD3陽性表達(dá)可能是宮頸鱗癌預(yù)后的潛在預(yù)測生物學(xué)標(biāo)志物。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多因素參與的復(fù)雜過程，其中包括抑癌基因失活、促癌基因激活、微環(huán)境的改變等多因素相互作用。已有研究顯示，F(xiàn)XYD3不僅在正常人體組織中廣泛表達(dá)，而且在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，近年來FXYD3作為一種潛在的新型癌癥生物學(xué)標(biāo)志物備受關(guān)注[12-13]。本研究采用cBioPortal數(shù)據(jù)庫共預(yù)測到與FXYD3共表達(dá)的基因417個。通路富集分析顯示，F(xiàn)XYD3共表達(dá)基因主要參與的通路包括癌癥相關(guān)通路(非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌及其他癌癥)，免疫、炎癥調(diào)節(jié)相關(guān)通路(T細(xì)胞、B細(xì)胞、白細(xì)胞介素-17)及各種營養(yǎng)代謝通路(蛋白質(zhì)水解、核黃素代謝、核酸合成代謝等)，機(jī)體免疫狀態(tài)、營養(yǎng)水平均可影響疾病易感性[14]，提示FXYD3可能與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)，但關(guān)于其在宮頸鱗癌中的表達(dá)及作用機(jī)制研究尚處于初級階段，還需深入探究。

綜上所述，F(xiàn)XYD3在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著升高，且與宮頸鱗癌組織類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)，可能成為監(jiān)測宮頸鱗癌進(jìn)展的有價值基因。然而，本研究僅分析了FXYD3在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，納入的宮頸鱗癌組織及正常組織樣本量較少，結(jié)果可能存在一定的局限性，是本研究不足之處。下一步我們將通過擴(kuò)大樣本量，探討FXYD3在宮頸鱗癌中的臨床意義，并根據(jù)FXYD3共表達(dá)基因相關(guān)通路進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)實驗，探討FXYD3在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的可能通路機(jī)制。