長(zhǎng)鏈非編碼RNA ZFAS1作為腫瘤預(yù)后因子的薈萃分析

李璐燕，陳夢(mèng)湘，何國(guó)獻(xiàn)，余敏，吳越，向惠英，邵世和

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212000；2.常州市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇常州213000)

癌癥作為一種由多種因素引起的疾病，具有較高的發(fā)病率和死亡率。癌癥的早期診斷是改善腫瘤患者預(yù)后的有效途徑之一[1]，尋找新的腫瘤標(biāo)志物對(duì)癌癥的早期診斷具有重要意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是長(zhǎng)度超過(guò)200 bp的非編碼RNA，其作為一種新的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)癌癥的診斷、治療和預(yù)后具有一定的臨床價(jià)值[2]。多種LncRNA已被證實(shí)與癌癥相關(guān)，例如，Chen等[3]發(fā)現(xiàn)沉默Lnc00958可以預(yù)防胰腺癌的進(jìn)展。Wu等[4]證實(shí)，lncHDAC2能促進(jìn)肝癌干細(xì)胞的擴(kuò)散和自我更新。Xiao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-TTTY15在前列腺癌組織中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)了前列腺癌的進(jìn)展。ZFAS1最初被證實(shí)在乳腺上皮分化和肺泡發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[6]。后續(xù)大量研究發(fā)現(xiàn)，該LncRNA在胃癌、食道癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌和其他癌癥患者中均呈異常表達(dá)[7-11]，且ZFAS1基因高表達(dá)患者的總生存率、無(wú)病生存率均較差[12-13]。然而，由于研究癌癥類型單一，樣本量小，結(jié)果不具有代表性。因此，本研究旨在通過(guò)薈萃(meta)分析確定ZFAS1與癌癥患者臨床預(yù)后的關(guān)系，并進(jìn)一步驗(yàn)證ZFAS1作為腫瘤標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

1 材料和方法

1.1文獻(xiàn)檢索策略 利用電子數(shù)據(jù)庫(kù)PubMed、Cochrane Library、Web of Science、Wiley Online Library等，使用以下關(guān)鍵詞：“ZFAS1”、“LncRNAZFAS1”或“l(fā)ong non-coding RNAZFAS1”、“cancer”和“tumor”進(jìn)行檢索。檢索日期截至2020年7月10日。

1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入研究需滿足以下條件：(1)與ZFAS1關(guān)聯(lián)的癌癥研究；(2)將患者分為基因高、低水平表達(dá)組，分類標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤組織中ZFAS1基因的表達(dá)水平；(3)提供相關(guān)的臨床資料；(4)提供生存分析相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)比率(hazard ratio，HR)和95%置信區(qū)間(95% confidence interval，CI)或可以獲取生存曲線。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)綜述、meta分析、病例報(bào)告和重復(fù)出版物；(2)臨床資料不足的研究。

1.3數(shù)據(jù)提取和質(zhì)量評(píng)估 提取數(shù)據(jù)包括：文章出版信息(包括作者名稱、出版時(shí)間、癌癥類型)、基因檢測(cè)方法，ZFAS1基因高、低表達(dá)組患者數(shù)量，臨床病理參數(shù)(包括TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、性別)以及生存相關(guān)(包括生存率和無(wú)病生存率)的HR值及95%CI、P值。研究質(zhì)量評(píng)估包括：(1)納入患者的選擇；(2)組間的可比性；(3)隨訪結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用危險(xiǎn)比(HR值)及95%CI評(píng)估ZFAS1與癌癥患者臨床預(yù)后之間的關(guān)系。在本次研究所納入的文章中，部分HR值可以直接從原文中獲取，部分研究并未提供，對(duì)于無(wú)法直接獲得HR值的研究則需通過(guò)原文中的生存曲線獲得原始數(shù)據(jù)，并使用Engauge Digitizer 4.2版軟件(http://digitizer.sourceforge.net/)計(jì)算HR值和95%CI。異質(zhì)性分析采用卡方Q檢驗(yàn)和HigginsI2統(tǒng)計(jì)量分析?；诤喜⑿?yīng)量的異質(zhì)性，選擇固定效應(yīng)模型或隨機(jī)效應(yīng)模型。當(dāng)異質(zhì)性明顯(I2>50%或P<0.05)時(shí)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型，反之則采用固定效應(yīng)模型。在臨床病理因素方面，將患者按照性別分為男性和女性，根據(jù)是否診斷為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為陽(yáng)性和陰性，根據(jù)TNM分期分為早期(Ⅰ+Ⅱ期)組和晚期(Ⅲ+Ⅳ期)。

2 結(jié)果

2.1研究選擇及特點(diǎn) 根據(jù)文獻(xiàn)篩選策略，共篩出152項(xiàng)研究。閱讀標(biāo)題和摘要后，有72篇文章因是動(dòng)物研究、綜述、meta分析或無(wú)關(guān)研究被刪除。通篇閱讀文章后，因缺乏生存結(jié)果或臨床病理參數(shù)的必要信息，有5篇文章被排除。最終選擇21篇文章進(jìn)行meta分析，共17種癌癥，其中包括肝癌2篇[13-14]，結(jié)直腸癌4篇[15-18]，大腸癌1篇[19]，胃癌1篇[20]，骨肉瘤1篇[21]，卵巢癌1篇[12]，非小細(xì)胞肺癌1篇[11]，膠質(zhì)瘤1篇[22]，膀胱癌1篇[23]，黑色素瘤1篇[24]，前列腺癌1篇[25]，腎透明細(xì)胞癌1篇[26]，膽管癌1篇[27]，食管鱗狀細(xì)胞癌1篇[28]，鼻咽癌1篇[29]，宮頸癌1篇[30]，子宮內(nèi)膜癌1篇[31]。所有患者均基于明確的病理診斷。本次研究共包含1 765例患者，且納入的研究均將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，分類標(biāo)準(zhǔn)為癌癥組織中ZFAS1表達(dá)情況，檢測(cè)方法均為qRT-PCR。21項(xiàng)研究均來(lái)自中國(guó)。見表1。

表1 本次meta分析納入研究的臨床特征

2.2ZFAS1表達(dá)與癌癥患者總生存率OS及無(wú)病生存率DFS的相關(guān)性 采用HR值及95%CI分析ZFAS1表達(dá)與患者生存率的關(guān)系。其中16項(xiàng)研究分析了總生存率OS與ZFAS1表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)，4項(xiàng)研究分析了無(wú)病生存率DFS與ZFAS1表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，總生存率HR合并結(jié)果為1.85(95%CI：1.67～2.05，Z=11.78，P<0.000 01)，見圖1A。無(wú)病生存率HR合并結(jié)果為1.92(95%CI：1.51～2.44，Z=5.35，P<0.000 01)，見圖1B。由于研究間不存在明顯異質(zhì)性，分析方法均采用固定效應(yīng)模型。此外，根據(jù)腫瘤類型進(jìn)行亞組分析，將納入的研究按照腫瘤種類分為消化系統(tǒng)腫瘤組(包括胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、膽管癌、大腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌)，呼吸系統(tǒng)腫瘤組(包括非小細(xì)胞肺癌、鼻咽癌)，泌尿生殖道系統(tǒng)腫瘤組(包括膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、腎透明細(xì)胞癌、前列腺癌、卵巢癌)及其他系統(tǒng)腫瘤組(包括膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、黑色素瘤)。結(jié)果顯示，ZFAS1高表達(dá)能夠顯著降低消化系統(tǒng)腫瘤(HR=1.78，95%CI：1.52～2.08，Z=7.18，P<0.000 01)，泌尿生殖道系統(tǒng)腫瘤(HR=2.03，95%CI：1.54～2.68，Z=4.99，P<0.000 01)，呼吸系統(tǒng)腫瘤(HR=1.64，95%CI：1.30～2.07，Z=4.16，P<0.0001)及其他腫瘤(HR=1.87，95%CI：1.68～2.07，Z=7.10，P<0.000 01)患者的生存率，見圖1C。

注：A，ZFAS1表達(dá)與癌癥患者總生存期OS相關(guān)性的森林圖；B，ZFAS1表達(dá)與癌癥患者無(wú)病生存期DFS相關(guān)性的森林圖；C，ZFAS1表達(dá)與癌癥患者總生存期OS相關(guān)性按癌癥類型亞組分析森林圖；degestive system,消化系統(tǒng)；respiratory system,呼吸系統(tǒng)；urogenital system,泌尿生殖系統(tǒng)；other system,其他系統(tǒng)。

2.3ZFAS1表達(dá)與癌癥患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 采用OR值及95%CI評(píng)估ZFAS1表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。其中15項(xiàng)研究共納入1 416例患者的臨床TNM分期數(shù)據(jù)，13項(xiàng)研究納入1 070例患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，8項(xiàng)研究納入629例患者的癌癥遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，16項(xiàng)研究納入1 447例患者的性別，具體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表2。分析結(jié)果顯示，ZFAS1基因高表達(dá)的患者與TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期(OR=2.87，95%CI：2.31～3.57，Z=9.55，P<0.000 01)，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=2.44，95%CI：1.40～4.25，Z=3.13，P=0.002)和腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(OR=1.90，95%CI：0.86～4.18，Z=1.59，P=0.000 9)有關(guān)。而患者性別與ZFAS1的表達(dá)并無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(OR=1.06，95%CI：0.86～1.31，Z=0.57，P=0.23)。見圖2。

注：A，TNM分期；B，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；C，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵襲；D，性別。

2.4web GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證結(jié)果 使用基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析數(shù)據(jù)庫(kù)web GEPIA分析ZFAS1在癌組織與癌旁組織中的表達(dá)水平，并通過(guò)對(duì)TCGA和GTEx項(xiàng)目RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與相應(yīng)的癌旁組織相比，ZFAS1在多種癌組織中均明顯升高。見圖3。

注：CHOL，膽管癌；COAD，結(jié)腸癌；DLBC，彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤；GBM，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤；KIRC，腎透明細(xì)胞癌；LGG，腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤；LIHC，肝臟肝細(xì)胞癌；nam(T),癌組織;num(N),癌旁組織。

2.5敏感性分析與發(fā)表偏倚 應(yīng)用Stata 12.0軟件檢測(cè)刪除數(shù)據(jù)對(duì)總生存率合并結(jié)果的影響，并驗(yàn)證結(jié)果的穩(wěn)健性，漏斗圖結(jié)果顯示不存在明顯發(fā)表偏倚。見圖4A、4B。

注：A，敏感性分析結(jié)果；B，漏斗圖。

3 討論

LncRNAs曾經(jīng)被認(rèn)為是基因垃圾，但越來(lái)越多的研究表明，它在腫瘤細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因剪接、翻譯和細(xì)胞成分的組裝等[32]。多種LncRNAs已經(jīng)被貼上致癌基因或腫瘤抑制基因的標(biāo)簽[33-34]，對(duì)腫瘤診斷具有重要價(jià)值。近年來(lái)，LncRNAsZFAS1被證實(shí)在多種腫瘤組織中異常表達(dá)。查閱文獻(xiàn)可知，其在結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、膽囊癌等消化系統(tǒng)腫瘤中的研究較為深入廣泛，但在其他類型癌癥中研究相對(duì)較少。本次meta分析基于以上研究基礎(chǔ)，綜合分析ZFAS1表達(dá)在各系統(tǒng)腫瘤預(yù)后診斷價(jià)值，亞組分析結(jié)果顯示，高表達(dá)的ZFAS1與消化系統(tǒng)、泌尿生殖道系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等腫瘤的低生存率均具有顯著相關(guān)性。此外，為重點(diǎn)研究ZFAS1表達(dá)水平與癌癥患者臨床病理參數(shù)之間的潛在聯(lián)系，筆者收集了患者性別、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與低表達(dá)組相比，ZFAS1高表達(dá)患者TNM分期更易發(fā)展為Ⅲ/Ⅳ期，且更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。綜上所述，高表達(dá)的ZFAS1與腫瘤患者的不良預(yù)后具有明顯相關(guān)性。

為進(jìn)一步探究ZFAS1在癌癥中發(fā)揮調(diào)控作用的分子機(jī)制，筆者發(fā)現(xiàn)目前針對(duì)該LncRNA的研究主要集中于競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(Competitive endogenous RNA, ceRNA)調(diào)控機(jī)制。ceRNA假說(shuō)最早由Leonardo Salmena等提出，該假說(shuō)論證了細(xì)胞中編碼和非編碼RNA是如何相互作用并進(jìn)一步影響細(xì)胞表型[35]。MicroRNA是具有代表性的非編碼RNA，其主要在分子水平上發(fā)揮重要作用，研究證實(shí)LncRNAZFAS1與多種miRNAs之間存在調(diào)控環(huán)路。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，筆者發(fā)現(xiàn)能夠與ZFAS1直接結(jié)合的MicroRNA主要有miR-150-5p[12,15,24,36-37]、miR-590-3p[38-40]、miR-1271-5p[41-42]、miR-193a-3p[43-44]、miR-421[45]，其中miR-150-5p、miR-590-3p被證實(shí)在多種癌癥中均能夠被ZFAS1特異性吸附。此外，ZFAS1調(diào)控的靶基因具有多樣性，可以從細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及細(xì)胞耐藥性等方面調(diào)控癌癥進(jìn)展。

本研究仍存在一定的局限性：(1)納入文章數(shù)量和樣本量有限；(2)所有納入的研究均在中國(guó)進(jìn)行，可能存在種族及地域差異；(3)本次meta分析僅包括英文出版物；(4)部分HR值無(wú)法從原文獲取，而是由生存曲線計(jì)算獲得。本研究還需在今后的臨床研究中驗(yàn)證。

綜上所述，本次meta分析證實(shí)ZFAS1是一種重要的腫瘤標(biāo)志物，高表達(dá)的ZFAS1預(yù)示著癌癥患者較差的生存期和不良的臨床預(yù)后。ZFAS1作為ceRNA直接或間接與MicroRNA結(jié)合，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。