LncRNA NPSR1-AS1在胃癌中的表達(dá)及作用機(jī)制

謝文杰,張鶴騰,唐銀炳,陸佳偉,侯雯躋,周曉東,徐穎,張文波,于強(qiáng),鄒晨

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院a.普外科,b.中心實(shí)驗(yàn)室,c.神經(jīng)外科,江蘇鎮(zhèn)江 212002)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在消化系統(tǒng)腫瘤中胃癌的發(fā)病率位居前列，是癌癥患者死亡的主要原因之一[1]。LncRNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，缺乏蛋白質(zhì)編碼能力，與DNA、RNA和蛋白質(zhì)相互作用，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[2]。LncRNA NPSR1-AS1主要定位于7號(hào)染色體p14.3。Huang等[3]從The Cancer Genome Atlas(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中分析了149例肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者的LncRNA表達(dá)模式以及相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)，其認(rèn)為NPSR1-AS1與HCC的預(yù)后相關(guān)，并有望成為HCC治療的靶標(biāo)。此外，He等[4]根據(jù)微陣列分析，認(rèn)為NPSR1-AS1是一種缺氧反應(yīng)性LncRNA；缺氧誘導(dǎo)的NPSR1-AS1可能通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK/ERK途徑來(lái)促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖和糖酵解，并有望用于HCC治療[4]。為研究NPSR1-AS1與胃癌的關(guān)系，本研究檢測(cè)了NPSR1-AS1在胃癌患者組織及血漿中的表達(dá)情況，結(jié)合患者的臨床病理資料，分析其與NPSR1-AS1表達(dá)量的關(guān)系，同時(shí)，還進(jìn)行了細(xì)胞功能學(xué)試驗(yàn)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，以期為臨床診療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1研究對(duì)象 收集2015年4月至2019年7月于江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普外科接受手術(shù)治療的86例胃腺癌患者的癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm)。女性24例，男性62例，年齡47～82歲，中位年齡68歲；腫瘤最大徑>5 cm者22例，≤5 cm者64例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者(N0)38例，陽(yáng)性者(N1-3)48例；胃癌TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期40例，Ⅲ～Ⅳ期46例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理科2名副主任醫(yī)師聯(lián)合診斷為胃腺癌；(2)所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及其他非手術(shù)的抑癌療法。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤者；(2)有高血壓、糖尿病、心臟病、肺部疾病和免疫系統(tǒng)疾病者。隨機(jī)選取上述胃癌患者中的21例(男性14例，女性7例，年齡52～76歲)，檢測(cè)血漿中NPSR1-AS1的表達(dá)水平。另外，隨機(jī)收集在本院體檢中心體檢的21例(男性12例，女性9例，年齡27～46歲)體檢健康者的血漿標(biāo)本作為對(duì)照組。本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：K20180016Y)。所有受試者及家屬均知情同意。

1.2細(xì)胞系、試劑和儀器 胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))。RNA提取試劑(Trizol，美國(guó)Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(日本TaKaRa公司)，siRNA-NPSR1-AS1小干擾RNA、陰性對(duì)照小干擾 RNA(上海吉瑪公司)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(江蘇碧云天公司)。Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)，NanoDrop 1000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(德國(guó) Eppendorf公司)，CFX96熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3RNA提取及RT-qPCR 采用苯酚-氯仿抽提法，按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)從胃癌組織、血漿及胃癌細(xì)胞中提取總RNA，并用NanoDrop 1000微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值為1.9～2.1的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。根據(jù)GenBank中的基因序列號(hào)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送上海生工公司合成(表1)。根據(jù)SYBRRT-RT-qPCR Mixture試劑說(shuō)明書(shū)配制體系，細(xì)胞、組織和血漿RT-qPCR體系：10 μL 2×PCR Mixture，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，1 μL模板cDNA，8.2 μL ddH2O。將上述體系置于ABI熒光定量PCR儀中檢測(cè)，循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，共40次循環(huán)。72 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)，使用7500 System Software-SDS 2.2軟件進(jìn)行熔解曲線分析。細(xì)胞和組織以β-actin為內(nèi)參基因，血漿以U6為內(nèi)參基因。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇胃癌AGS細(xì)胞，取1×105個(gè)細(xì)胞(每孔200 μL)鋪于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)，待其細(xì)胞密度達(dá)60%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)操作，用無(wú)血清培養(yǎng)基配制轉(zhuǎn)染試劑及si-RNA工作液，試驗(yàn)設(shè)2組，分別為：si-NPSR1-AS1組(50 μL無(wú)血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液+2 μL Lipofectamine2000+2 μL si-NPSR1-AS1)；si-NC組(50 μL無(wú)血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液+2 μL Lipofectamine2000+ 2 μL si-NC)，分別混勻靜置20 min后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4～6 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取上述轉(zhuǎn)染48 h后的AGS細(xì)胞(si-NPSR1-AS1組和si-NC組)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，重懸并計(jì)數(shù)，以每孔1×104個(gè)的細(xì)胞密度接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每3 d更換1次，每隔24 h在光學(xué)顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)，結(jié)果取均值，連續(xù)計(jì)數(shù)5 d，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量繪制生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算細(xì)胞增殖能力。

1.6平板克隆形成試驗(yàn) 取上述轉(zhuǎn)染48 h后的AGS細(xì)胞(si-NPSR1-AS1組和si-NC 組)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，重懸并計(jì)數(shù)，以每孔1×103個(gè)的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基每3 d更換1次。在培養(yǎng)后的第10天，將細(xì)胞用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.5%結(jié)晶紫避光染色15 min，再用PBS清洗2～3次，待自然風(fēng)干后，光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)大于30個(gè)細(xì)胞、集落大小為0.4～1.0 mm的克隆。

1.7Transwell 細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn)

1.7.1遷移試驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染48 h后的AGS細(xì)胞(si-NPSR1-AS1組和si-NC 組)，2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL。然后以每孔200 μL接種于Transwell小室上室，下室中每孔加入750 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.5%結(jié)晶紫染色15 min，棉簽擦去上室面殘余細(xì)胞，用熒光顯微鏡拍照并隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野(×100)的細(xì)胞數(shù), 結(jié)果取均值。

1.7.2侵襲試驗(yàn) 取無(wú)血清培養(yǎng)基44 μL和Matrigel 6 μL混合稀釋，滴入Transwell小室中包被上室膜，然后置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱溫育4 h。其余步驟同遷移試驗(yàn)。

1.8細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 取上述轉(zhuǎn)染48 h后的AGS細(xì)胞(si-NPSR1-AS1組和si-NC 組)，1×Binding buffer重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并加入PBS，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，依次加入10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI混合，避光靜置15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 7.0軟件分析制圖。所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NPSR1-AS1在胃癌組織及血漿中的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，86例胃癌組織標(biāo)本中NPSR1-AS1的相對(duì)表達(dá)量(3.98±0.36)顯著高于癌旁組織(2.78±0.31)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.51，P<0.05)。而21例胃癌患者血漿中NPSR1-AS1的相對(duì)表達(dá)量(4.35±0.39)亦顯著高于21例體檢健康者(2.51±0.50),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.89，P<0.01)。

2.2NPSR1-AS1在胃癌組織及血漿中的臨床應(yīng)用價(jià)值 NPSR1-AS1在86例胃癌組織中相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)為0.913，以此為界將胃癌患者分為高表達(dá)組(n=43)和低表達(dá)組(n=43)。結(jié)合臨床病理資料，分析其與NPSR1-AS1表達(dá)量的關(guān)系，結(jié)果顯示NPSR1-AS1高表達(dá)與腫瘤大小(t=11.02，P<0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(t=2.30，P<0.05)、腫瘤血管或神經(jīng)侵襲(t=3.09，P<0.01)和TNM分期(t=3.55，P<0.01)密切相關(guān)。而與性別、年齡、是否吸煙、飲酒等無(wú)顯著相關(guān)性(表2)。Kaplan-Meier分析表明，NPSR1-AS1高表達(dá)組患者的生存率明顯低于低表達(dá)組(HR=2.58,95%CI:1.38～4.71,P<0.05,圖1A)。胃癌患者血漿NPSR1-AS1水平診斷胃癌的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.696，95%CI為0.534～0.858，當(dāng)cut-off值為9.52時(shí)，特異性為90.5%，敏感性為47.6%。見(jiàn)圖1B。

注：A，NPSR1-AS1表達(dá)與胃癌患者生存率之間的相關(guān)性；B，血漿NPSR1-AS1表達(dá)水平的ROC曲線。

表2 胃癌患者組織中NPSR1-AS1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3NPSR1-AS1敲減后對(duì)AGS細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞48 h后經(jīng)RT-qPCR結(jié)果證實(shí)，siRNA的敲減效率滿意，其表達(dá)量(1.03±0.01)與對(duì)照組(0.57±0.02)相比，下降了54.5%(t=18.92，P<0.05，圖2A)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及平板克隆形成試驗(yàn)結(jié)果表明，NPSR1-AS1敲減后能抑制AGS細(xì)胞的增殖能力(t=2.789，P<0.05，圖2B；t=14.00，P<0.05，圖2C)。Transwell遷移和侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明，NPSR1-AS1敲減后能抑制AGS細(xì)胞的遷移及侵襲能力(t=25.45，P<0.05，圖2D)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，si-NPSR1-AS1凋亡(早期凋亡+晚期凋亡)比例為9.43%，明顯高于si-NC組的5.22%(t=21.45，P<0.001，圖2E)，表明NPSR1-AS1敲減可誘導(dǎo)AGS細(xì)胞的凋亡。

注：A，NPSR1-AS1敲減后在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平；B、C,細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及平板克隆試驗(yàn)檢測(cè)NPSR1-AS1敲減后對(duì)AGS細(xì)胞增殖能力的影響；D，Transwell試驗(yàn)檢測(cè) NPSR1-AS1敲減后對(duì)AGS細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響；E，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NPSR1-AS1敲減后對(duì)AGS細(xì)胞凋亡的影響。**，P<0.01；***，P<0.001。

2.4NPSR1-AS1敲減后對(duì)腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響 NPSR1-AS1敲減后，RT-qPCR檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GSK-3β和E-cadherin的表達(dá)量(分別為1.86±0.05、1.59±0.06)明顯上調(diào)(t分別為16.15和10.17,P均<0.01)，而β-catenin、N-cadherin、Snail和MMP2的表達(dá)量(分別為0.71±0.05、0.70±0.08、0.39±0.07、0.23±0.04)顯著下調(diào)(t分別為4.869、3.77和9.372,P均<0.01)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA可通過(guò)調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等多種生物學(xué)行為，直接或間接干擾基因表達(dá)，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用[5]。本課題組發(fā)現(xiàn)的LINC01225[6]在胃癌組織中高表達(dá)，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程。Yang等[7]發(fā)現(xiàn)，LINC00665在胃癌中的表達(dá)下調(diào)，在胃癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用。目前關(guān)于NPSR1-AS1的研究甚少，至今還未證實(shí)其在胃癌中的作用機(jī)制。為了探討NPSR1-AS1在胃癌中是否發(fā)揮促癌作用，本研究發(fā)現(xiàn)NPSR1-AS1在胃癌患者組織及血漿中的表達(dá)水平明顯升高，其高表達(dá)與胃癌患者腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤血管或神經(jīng)侵襲和TNM分期顯著相關(guān)，并且高表達(dá)患者的術(shù)后總生存率明顯降低，表明NPSR1-AS1在胃癌中發(fā)揮著促癌作用并導(dǎo)致其不良預(yù)后。筆者通過(guò)進(jìn)一步的細(xì)胞功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NPSR1-AS1可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，表明其能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，LncRNA可以通過(guò)靶向不同的分子標(biāo)志物直接或間接地調(diào)節(jié)EMT過(guò)程，從而發(fā)揮促腫瘤作用[8]。而NPSR1-AS1能否也通過(guò)EMT實(shí)現(xiàn)這一過(guò)程目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，NPSR1-AS1敲減后GSK-3β和E-cadherin的表達(dá)上調(diào)，而β-catenin、N-cadherin、Snail和MMP2的表達(dá)下調(diào)，EMT相關(guān)基因變化明顯。有文獻(xiàn)顯示，GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種細(xì)胞活動(dòng)中起關(guān)鍵作用，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞周期等[9]。在多個(gè)信號(hào)通路中，如Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、Hedgehog、Notch等，GSK-3β均具有重要的中心樞紐作用，進(jìn)而調(diào)控疾病的進(jìn)展[10]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在EMT啟動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，該信號(hào)通路活化后可以通過(guò)抑制GSK-3β的活性,致使β-catenin不能被GSK-3β磷酸化，導(dǎo)致游離β-catenin大量入核，而β-catenin在核內(nèi)可以作為轉(zhuǎn)錄因子的亞單位,從而誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)以激活EMT過(guò)程。相反，GSK-3β過(guò)表達(dá)后可以抑制EMT過(guò)程[11]。本研究結(jié)果證實(shí)，NPSR1-AS1敲減后GSK-3β水平上調(diào)，從而抑制了β-catenin及EMT信號(hào)。Zheng等[12]發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1可以作為GSK-3β負(fù)調(diào)節(jié)劑，抑制GSK-3β表達(dá)以降低β-catenin活性，從而影響結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性行為。因此，筆者推測(cè)NPSR1-AS1可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，刺激幾種與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)EMT過(guò)程。

本課題組在前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NPSR1-AS1在胃癌患者組織及血漿中的表達(dá)水平升高，且與胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)，本研究進(jìn)一步探討了NPSR1-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，但未探究細(xì)胞周期等其他生物學(xué)行為的影響。此外，NPSR1-AS1可能通過(guò)調(diào)節(jié)GSK-3β的表達(dá)水平，從而調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路以誘導(dǎo)腫瘤的EMT過(guò)程，但尚缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。在后續(xù)研究中，本課題組將進(jìn)一步研究NPSR1-AS1如何調(diào)控GSK-3β的表達(dá)來(lái)影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的具體機(jī)制，以期為尋找新的胃癌治療靶標(biāo)提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。