雷帕霉素的水解行為及對4 種非靶標生物的急性毒性

楊石有, 董師旭, 史儒松, 蒲金基,董金皋, 劉穎超*,, 張 賀*,

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，河北 保定 071001；2. 海南大學 林學院，海口 570228；3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 環(huán)境與植物保護研究所，?？?571101；4. 河北農(nóng)業(yè)大學 河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北 保定 071001)

雷帕霉素 (rapamycin) 又名西羅莫司 (Sirolimus)，最早是從吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus中分離獲得的一類三十六元環(huán)的含氮三烯大環(huán)內(nèi)酯類次級代謝產(chǎn)物，具有良好的抑制真菌[1]和腫瘤[2]的活性，同時也是很強的免疫抑制劑[3]。雷帕霉素靶蛋白mTOR 是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白，普遍存在于真核生物體內(nèi)，其靶標TOR 蛋白激酶通過對蛋白質(zhì)的合成及其穩(wěn)定性以及對轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控而抑制真菌和腫瘤細胞的生長[4-5]，甚至可通過自我吞噬作用誘導細胞程序性死亡而調(diào)控真核細胞的生長[6]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)：雷帕霉素可延長小鼠壽命[7]；有效阻斷癌細胞的擴散和發(fā)展，在某些小鼠機體中，雷帕霉素甚至可加速腫瘤的消亡[8]；可預防糖尿病及相關(guān)心臟并發(fā)癥[9]；對血液疾病具有一定的治療作用[10]。

相對于醫(yī)學領(lǐng)域，關(guān)于雷帕霉素在農(nóng)業(yè)方面的研究較少，但隨著研究的深入，已發(fā)現(xiàn)雷帕霉素對害蟲及植物病原菌具有較好的生物活性。李佳芮等[11]研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可提高斜紋夜蛾Spodoptera litura的自噬水平。經(jīng)雷帕霉素處理后，禾谷鐮孢Fusarium graminearum菌絲膨大扭曲，隔膜變多，菌絲內(nèi)脂肪體積累[12]。Meléndez 等[13]發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素對番茄灰霉病菌Botrytis cinerea具有明顯拮抗活性。王彥等[14]的研究表明，雷帕霉素對油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani和棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum具有較好的抑制活性，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雷帕霉素處理后，菌絲表現(xiàn)出提前衰老等癥狀。魏寧等[15]研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素對玉米大斑病菌Setosphaeria turcica分生孢子萌發(fā)、附著胞形成及穿透能力均有不同程度的抑制作用。呂秀蘭等[16]將雷帕霉素與甲霜·噁霉靈復配，發(fā)現(xiàn)其對馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani具有較好的抑制作用。

農(nóng)藥在施用過程中不可避免地會出現(xiàn)飄移、流失等現(xiàn)象[17]，進入環(huán)境中的農(nóng)藥，除了會對土壤和水體造成污染外，還可能引起非靶標生物的中毒或死亡。農(nóng)藥的環(huán)境行為是評價其在環(huán)境中殘留特性的重要指標[18]，研究農(nóng)藥在環(huán)境中的降解和歸趨，對于科學使用農(nóng)藥，減少環(huán)境污染和降低對非靶標生物的危害具有重要意義[19]。

農(nóng)藥對非靶標生物的安全性評價是新農(nóng)藥開發(fā)與應用中必不可少的環(huán)節(jié)，不僅可為新農(nóng)藥的登記提供基礎(chǔ)毒理學數(shù)據(jù)，還可為其科學合理使用提供理論依據(jù)與指導[20]。雷帕霉素作為極具潛力的生物源農(nóng)藥，隨著相關(guān)研究的深入，將會在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到越來越多的應用，而目前關(guān)于其環(huán)境行為及對非靶標生物的安全性還未見報道。因此，本研究模擬自然環(huán)境條件，研究了不同pH 值、初始濃度、光源對雷帕霉素水解的影響，同時參照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》方法，開展了雷帕霉素原藥對家蠶、意大利工蜂、斑馬魚及赤子愛勝蚯蚓4 種非靶標生物的急性毒性試驗，以期為其科學合理使用及環(huán)境風險評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Chromaster 高效液相色譜儀，帶紫外檢測器(日立高新技術(shù)公司)；AB135-S 萬分之一電子天平(廣州君達儀器公司)；KQ-250DE 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE5003 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州華特儀器設(shè)備有限公司)；SW-CJ-2FD 垂直超凈工作臺 (科銳特潔凈科技有限公司)；GR60DA自動壓力蒸汽滅菌鍋 (上海諾頂儀器設(shè)備有限公司)；PQX-250 智能人工氣候箱 (常州市儀都儀器有限公司)；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 (上海高致精密儀器有限公司)。

雷帕霉素 (rapamycin) 標準品 (98%，北京索萊寶科技有限公司)；二氯甲烷、二甲基亞砜、丙酮、氯化鈉、乙酸、乙酸鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉均為分析純；乙腈為色譜純。

1.2 供試生物

家蠶Bombyx mori，品種為菁松 × 皓月，卵塊購于山東廣通蠶種集團有限公司，采用常規(guī)方法催青，于 (25 ± 2) ℃、相對濕度70%～85%恒溫人工氣候箱中飼養(yǎng)。意大利工蜂Apis melliiferaL.，購于海南省儋州市那大鎮(zhèn)養(yǎng)蜂場。斑馬魚Brachydanio rerio，購于海南省儋州市那大鎮(zhèn)花鳥市場，體長約3 cm，于實驗室馴化7 d，挑選健康活潑、大小一致的幼魚進行試驗，試驗前24 h 停止喂食。赤子愛勝蚯蚓Eisenia foetida，購于天津賈立明蚯蚓養(yǎng)殖中心，于室溫20 ℃條件下避光馴養(yǎng)，挑選已出現(xiàn)繁殖環(huán)帶的健康成年蚯蚓供試。

1.3 標準溶液配制及標準曲線繪制

準確稱取0.025 g (精確至0.000 1 g) 雷帕霉素標準品，用丙酮溶解并定容至50 mL，配成質(zhì)量濃度為500 mg/L 的母液，置于 -20 ℃冰箱避光保存。試驗時再用丙酮稀釋至2.5～50 mg/L，采用高效液相色譜儀 (HPLC) 進行測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4 液相色譜檢測條件

色譜柱：Amethyst C18-H (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相：V(乙腈) :V(水) = 90 : 10；檢測波長278 nm；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。在此條件下，雷帕霉素保留時間為5.313 min。

1.5 雷帕霉素的水解行為研究

1.5.1 雷帕霉素在不同pH 值緩沖溶液中的水解

不同pH 值緩沖溶液配制參照程功等[21]的方法。分別用滅菌后pH 值為5、7、9 的緩沖溶液將雷帕霉素母液配制成 10 和50 mg/L 的溶液，攪拌均勻后分裝于棕色容量瓶中，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光保存，每處理重復3 次。分別于4、8、12、24 h 和2、4、6、8、10 d 取樣檢測，考察雷帕霉素在不同pH 值緩沖溶液中的水解情況。

1.5.2 雷帕霉素在不同溫度下的水解 用無菌水將雷帕霉素母液配制成 10 和50 mg/L 的溶液，攪拌均勻后分裝于棕色容量瓶中，分別置于25 和50 ℃恒溫水浴鍋中避光保存，每處理重復3 次。分別于4、8、12、24 h 和2、4、6、8、10 d 取樣檢測，考察雷帕霉素在不同溫度下的水解情況。

1.5.3 雷帕霉素在不同光源中的水解 用無菌水將雷帕霉素母液配制成 10 和50 mg/L的溶液，攪拌均勻后分裝于白色容量瓶中，分別置于窗邊自然光照和超凈工作臺中距紫外燈10 cm處 (輻射照度為3.00 mW/cm2，額定功率為8 W × 2)，每處理重復3 次。分別于4、8、12、24 h 和2、4、6、8、10 d 取樣檢測，考察雷帕霉素在不同光源中的水解情況。

1.5.4 樣品前處理 將各處理樣品分別置于分液漏斗中，加入10 mL 二氯甲烷和1.0 g 氯化鈉晶體，充分振蕩3 min，靜置分層，取下層有機相；重復提取1 次。合并有機相于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，40 ℃濃縮至1 mL 左右，加入色譜純乙腈溶解，轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，過0.45 μm濾膜后采用 HPLC 測定。

1.6 雷帕霉素對4 種非靶標生物的急性毒性測定

1.6.1 雷帕霉素對家蠶的急性毒性試驗 參照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則 第11 部分：家蠶急性毒性試驗》[22]，采用浸葉法處理。在預試驗基礎(chǔ)上，將雷帕霉素母液用自來水分別稀釋為1 000、500、200、100 和50 mg/L 5 個質(zhì)量濃度，將新鮮干凈的桑葉置于各濃度藥液中浸漬10 s，取出晾干后放入墊有濾紙、直徑 12 cm 的培養(yǎng)皿中，每皿分別接入20 頭2 齡起蠶。每處理重復3 次。以清水和加體積分數(shù)0.5%二甲基亞砜的水溶液為對照。處理后置于 (25 ± 2) ℃、相對濕度70%～85%恒溫人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)，分別于24、48、96 h 觀察家蠶的中毒癥狀及死亡情況，計算96 h-LC50值。家蠶的中毒癥狀參照陳偉國等[23]所用的方法進行評價。

1.6.2 雷帕霉素對意大利工蜂的急性毒性試驗

參照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則 第10 部分: 蜜蜂急性毒性試驗》[24]方法進行。

急性經(jīng)口毒性：用50%的蔗糖水溶液將雷帕霉素母液稀釋為1 000、500、250、125 和62.5 mg/L 5 個質(zhì)量濃度，取200 μL 分別加入飼喂器(離心管) 并稱重。每個蜂籠接入10 頭蜂，3 h 后取出飼喂器并稱重，記錄每組藥液的消耗量。之后飼喂不含藥液的50%蔗糖水溶液。以50%蔗糖水溶液和含體積分數(shù) 0.1%二甲基亞砜的水溶液為對照，每處理重復3 次。將試驗蜂籠置于黑布遮蓋的飼養(yǎng)架上，分別于24 和48 h 觀察記錄意大利工蜂的中毒癥狀和死亡數(shù)，計算48 h-LD50值。

急性接觸毒性：用丙酮將雷帕霉素母液分別稀釋為50、25、12.5、6.25 和3.125 mg/mL 5 個質(zhì)量濃度，用微量點滴儀吸取1.0 μL 各濃度藥液點滴于意大利工蜂中胸背板上。待藥液晾干后轉(zhuǎn)入蜂籠中，用50%蔗糖水飼喂。以點滴1.0 μL 丙酮的處理為空白對照，每處理重復3 次，每重復10 頭蜂。分別觀察記錄24 及48 h 時意大利工蜂的中毒癥狀和死亡數(shù)，計算48 h-LD50值。

1.6.3 雷帕霉素對斑馬魚的急性毒性試驗 參照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則 第12 部分: 魚類急性毒性試驗》[25]，采用半靜態(tài)法進行。將雷帕霉素母液用脫氯的自來水分別配制成20、10、5、2.5 和1.25 mg/L 系列質(zhì)量濃度的藥液。斑馬魚在室內(nèi)馴養(yǎng)7 d 后，挑選體長大小一致、健康活潑的幼魚，分別飼養(yǎng)于不同濃度藥液中，以曝氣并加入相同體積溶劑的自來水為空白對照，每處理重復3 次，每重復10 條斑馬魚。于試驗開始后 6 h內(nèi)隨時觀察記錄受試魚的中毒及死亡情況，之后在24、48、72 及96 h 分別繼續(xù)觀察其中毒及死亡情況，及時清除死魚，計算96 h-LC50值。試驗體系藥液體積為5 L，試驗周期為96 h，每隔24 h更換原有全部藥液，并測定試驗體系的pH 值、溫度及溶解氧含量 (DO)，以保持試驗條件穩(wěn)定。

1.6.4 雷帕霉素對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性試驗

參照《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則 第15 部分：蚯蚓急性毒性試驗》[26]，采用土壤接觸法進行。將雷帕霉素母液用蒸餾水分別配成3 000、2 000、1 000、500 及250 mg/L 系列質(zhì)量濃度的藥液，分別取100 mL 不同質(zhì)量濃度的雷帕霉素藥液與500 g 土樣混合并充分攪拌，加蒸餾水調(diào)節(jié)土壤含水量至30%～35%，使毒土中雷帕霉素的質(zhì)量分數(shù)分別為600、400、200、100 和50 mg/kg。將土樣裝入標本瓶中，用紗布封口，每處理重復3 次，每重復放入10 條蚯蚓。將標本瓶置于(20 ±1) ℃、相對濕度80%～ 85%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于第7 天和第14 天倒出瓶內(nèi)土壤，觀察記錄蚯蚓的中毒及死亡情況，及時清除死蚯蚓，計算14 d-LC50值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

雷帕霉素在不同條件下的水解按照一級反應動力學方程Ct=C0e-kt進行擬合。消解半衰期 (t1/2) 按t1/2= ln2/k計算；溫度效應系數(shù) (Q) 按Q=k(t+10)/kt計算；其中：Ct為t時刻雷帕霉素的質(zhì)量濃度(mg/L)；C0為雷帕霉素初始質(zhì)量濃度 (mg/L)；k為消解速率常數(shù) (h-1)。

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件中的Probit 回歸方法計算雷帕霉素對4 種非靶標生物的急性毒性LC50(LD50) 值，并通過Duncan 氏新復極差法檢驗對試驗結(jié)果進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法的驗證

采用外標法進行定量。結(jié)果表明，在2.5～50 mg/L 范圍內(nèi)，雷帕霉素的峰面積與進樣質(zhì)量濃度間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y= 15 054x-5 350.1，相關(guān)系數(shù)r為0.999 9。在1、10 和50 mg/L添加水平下，平均回收率在89%～96%之間，相對標準偏差 (RSD) 在1.3%～2.4%之間，儀器檢出限(LOD) 為0.027 mg/L，定量限 (LOQ) 為0.09 mg/L，雷帕霉素與其他雜質(zhì)分離較好，表明所用方法可滿足雷帕霉素定量檢測要求，相關(guān)譜圖見補充材料附圖1 和附圖2。

2.2 雷帕霉素在不同條件下的水解動態(tài)

2.2.1 雷帕霉素在不同pH 值下的水解 結(jié)果 (表1)表明：雷帕霉素在不同pH 值緩沖溶液中的水解存在一定差異，堿性條件下更有利于其水解；相同pH 值條件下，則初始濃度越高，半衰期越長。

表1 雷帕霉素在不同pH 值條件下的水解動力學參數(shù)Table 1 Hydrolysis kinetics parameters of rapamycin under different pH values

2.2.2 雷帕霉素在不同溫度下的水解 結(jié)果 (表2)

表2 雷帕霉素在不同溫度下的水解動力學參數(shù)Table 2 Hydrolysis kinetics parameters of rapamycin under different temperatures

表明：雷帕霉素在不同溫度下的水解存在一定差異。相同初始濃度下，溫度越高其水解速度越快；相同溫度條件下，則初始濃度越高，水解速度越慢。雷帕霉素的水解速度可用溫度效應系數(shù)(Q) 進行評價，Q值越大，水解越快。

2.2.3 雷帕霉素在不同光源下的水解 結(jié)果 (表3)表明：雷帕霉素在不同光源下的水解也存在一定差異。相同初始濃度下，雷帕霉素在紫外光條件下的水解速度較自然光下快，初始質(zhì)量濃度為10 mg/L 的雷帕霉素在自然光下的半衰期是紫外光下的1.98 倍；相同光源下，則初始濃度越高，水解速度越慢，紫外光下，初始質(zhì)量濃度為50 mg/L的雷帕霉素的半衰期是10 mg/L 時的2.7 倍。

表3 雷帕霉素在不同光源下的水解動力學參數(shù)Table 3 Hydrolysis kinetics parameters of rapamycin under different light sources

2.3 雷帕霉素對4 種非靶標生物的急性毒性

測定結(jié)果 (表4)表明，雷帕霉素對4 種非靶標生物的急性毒性存在一定差異，其中對家蠶、赤子愛勝蚯蚓及意大利工蜂的急性接觸毒性表現(xiàn)為 “低毒”，對斑馬魚和意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性表現(xiàn)為 “中毒”。

表4 雷帕霉素對4 種非靶標生物的急性毒性Table 4 Acute toxicity of rapamycin to four non-target organisms

2.3.1 雷帕霉素對家蠶的急性毒性 2 齡家蠶經(jīng)不同濃度雷帕霉素處理后，其中毒癥狀存在一定差異：低濃度處理組與對照組無明顯差異，高濃度組家蠶出現(xiàn)頭部翹起、體縮、吐液癥狀。處理后24 h 與對照組無明顯差異，48 h 后出現(xiàn)中毒癥狀及少量死亡現(xiàn)象，96 h 后處理組家蠶多數(shù)出現(xiàn)體縮、吐液及死亡現(xiàn)象。對存活的家蠶繼續(xù)飼喂健康葉片，觀察發(fā)現(xiàn)雷帕霉素對家蠶生長發(fā)育具有一定的延緩作用。雷帕霉素對家蠶的24、48、72 及96 h LC50值見補充材料附表1。隨著染毒時間延長，雷帕霉素對家蠶的毒性逐漸升高，不同染毒時間之間LC50值差異達顯著水平。雷帕霉素對家蠶的 96 h-LC50值為有效成分386.46 mg/L，根據(jù)試驗準則中農(nóng)藥對家蠶的毒性等級劃分標準[22]，可知雷帕霉素對家蠶的急性毒性等級為 “低毒”。

2.3.2 雷帕霉素對意大利工蜂的急性毒性 分別測定了雷帕霉素對意大利工蜂的急性經(jīng)口和接觸毒性。處理后24 h，低濃度組未出現(xiàn)中毒和死亡現(xiàn)象，高濃度組部分蜂出現(xiàn)抽搐、死亡現(xiàn)象；48 h 后，低濃度組部分蜂出現(xiàn)中毒癥狀，有少量死亡，高濃度組大部分意大利工蜂死亡，死亡蜂體表現(xiàn)為腹部彎曲變黑、展翅現(xiàn)象。雷帕霉素對意大利工蜂的24、48 h 急性經(jīng)口和接觸毒性LD50值見補充材料附表2。隨著染毒時間延長，雷帕霉素對意大利工蜂的毒性逐漸升高，不同染毒時間之間LD50值差異達顯著水平。雷帕霉素對意大利工蜂的48 h 急性經(jīng)口毒性LD50值為有效成分8.95 μg/bee，48 h 急性接觸毒性LD50值為有效成分16.79 μg/bee，根據(jù)試驗準則中農(nóng)藥對蜜蜂的毒性等級劃分標準[24]，可知雷帕霉素對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性等級為 “中毒”，急性接觸毒性等級為 “低毒”。

2.3.3 雷帕霉素對斑馬魚的急性毒性 斑馬魚在不同濃度雷帕霉素藥液中的中毒程度和死亡率與藥劑濃度呈正相關(guān)，藥劑濃度越高，中毒癥狀出現(xiàn)越早，癥狀越明顯。高濃度 (20 mg/L) 組斑馬魚逐漸表現(xiàn)出反應遲緩、游速減慢、鰓部發(fā)紅、側(cè)游等中毒癥狀，低濃度處理組則反應不明顯；隨著染毒時間延長，高濃度組斑馬魚死亡數(shù)逐漸增多，死亡斑馬魚表現(xiàn)為魚體發(fā)白、腹部腫大、魚鰭張開、腮部淤血等癥狀，并沉于水底。雷帕霉素對斑馬魚的24、48、72 及96 h LC50值見補充材料附表3。隨著染毒時間延長，雷帕霉素對斑馬魚的毒性逐漸升高，不同染毒時間之間LC50值差異達顯著水平。雷帕霉素對斑馬魚的96 h-LC50值為有效成分3.50 mg/L，根據(jù)試驗準則中農(nóng)藥對魚類的毒性等級劃分標準[25]，雷帕霉素對斑馬魚的急性毒性等級為 “中毒”。

2.3.4 雷帕霉素對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性 赤子愛勝蚯蚓的死亡率與藥劑濃度和染毒時間呈正相關(guān)，隨著藥劑濃度升高和染毒時間延長，蚯蚓的死亡率逐漸升高。低濃度雷帕霉素對赤子愛勝蚯蚓影響不大，高濃度處理組蚯蚓出現(xiàn)黃色體液滲出、局部腫大潰爛、環(huán)帶膨大等中毒癥狀，對照組未出現(xiàn)死亡情況。雷帕霉素對蚯蚓的7 d 和14 d LC50值見補充材料附表4。隨著染毒時間延長，雷帕霉素對蚯蚓的毒性逐漸升高，不同染毒時間之間LC50值差異達顯著水平。雷帕霉素對蚯蚓的14 d-LC50值為有效成分223. 81 mg/kg (干土)，根據(jù)試驗準則中農(nóng)藥對蚯蚓的毒性等級劃分標準[26]，雷帕霉素對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性等級為 “低毒”。

3 結(jié)論與討論

農(nóng)藥的環(huán)境行為研究及對非靶標生物的安全性評價是新農(nóng)藥登記的必備材料，也是評價農(nóng)藥環(huán)境安全性的重要依據(jù)。本實驗室前期研究結(jié)果表明，雷帕霉素對芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、擬輪枝鐮孢Fusarium verticillioides及水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae的抑制活性明顯高于市售的常見殺菌劑 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。雷帕霉素作為極具潛力的生物源農(nóng)藥，開展其水解行為研究及對非靶標生物的安全性評價具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素在不同環(huán)境條件下的水解速度存在差異：在不同pH 值條件下其水解速度依次為pH 9＞pH 7＞pH 5；相同初始濃度下，溫度越高水解速度越快，相同溫度下，則初始濃度越高水解速度越慢；相同初始濃度下，其在紫外光下的水解速度較自然光下快，相同光源下，則初始濃度越高水解速度越慢。根據(jù)不同環(huán)境條件下的半衰期判斷，雷帕霉素屬于易降解性藥劑。對4 種非靶標生物的急性毒性試驗結(jié)果表明，雷帕霉素對家蠶及赤子愛勝蚯蚓 “低毒”，對斑馬魚為 “中毒”，對意大利工蜂的經(jīng)口毒性為“中毒”、接觸毒性為 “低毒”。

水解是農(nóng)藥的主要環(huán)境化學行為，包括農(nóng)藥在水環(huán)境中的微生物降解、化學降解與光降解，是評價農(nóng)藥在水體中殘留特性的重要指標[27]。農(nóng)藥的水解除與藥劑自身性質(zhì)有關(guān)外，還與水體pH 值、溫度、水質(zhì)、光源、初始濃度、有機溶劑、光敏劑、光猝滅劑、催化劑和氧化劑等因素有關(guān)[28]。水體的酸堿性是影響農(nóng)藥水解的重要因素之一，溶液中的H+和OH-均可催化農(nóng)藥的水解。農(nóng)藥自身結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不一樣，在不同酸堿性緩沖溶液中的水解速度也不一樣。張雙等[28]發(fā)現(xiàn)2,4-滴異辛酯在酸性環(huán)境中降解較快，而程功等[21]發(fā)現(xiàn)丙炔氟草胺 (flumioxazin) 在堿性環(huán)境中降解較快。本研究中雷帕霉素的水解速度與溶液pH 值呈正相關(guān)，這與同為大環(huán)內(nèi)脂類抗生素的阿維菌素 (abamectin) 在不同pH 值條件下的降解行為一致[29]，這可能是由于堿性條件下大量OH-促進了雷帕霉素的反應，從而導致其水解加快。在一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度升高，化學反應的活化能(Ea) 增大，反應速率加快，從而導致水解速度加快，本研究中雷帕霉素的水解速度隨著溫度的升高而加快，這也與阿維菌素原藥在不同水溫中的降解行為一致[29]。光照是農(nóng)藥降解的重要因素之一，當光源的輻射波長與藥劑自身的最大吸收波長相近時，藥劑的降解速度較快。本研究中雷帕霉素在紫外光下的水解速度快于自然光下，這可能與雷帕霉素最大吸收波長 (277 nm)[30]與紫外燈的輻射波長 (254 nm) 相適應有關(guān)，這也與阿維菌素原藥的光降解結(jié)果一致[31]。由于本研究中選用白色玻璃容量瓶盛放藥液，對紫外光有一定的阻隔作用，因此雷帕霉素在紫外光中的水解特性還有待進一步研究。

家蠶、蜜蜂、斑馬魚及蚯蚓是農(nóng)藥環(huán)境安全性評價研究常用靶標對象。目前有關(guān)農(nóng)藥對家蠶的毒性研究主要集中在急性毒性和中毒癥狀觀察方面。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度雷帕霉素處理組家蠶和空白對照無明顯差異，高濃度處理組家蠶出現(xiàn)吐液、頭部翹起、身體縮短等中毒癥狀，與文獻報道的癥狀[32]一致。同時測得雷帕霉素對家蠶的96 h-LC50值為386.46 mg/L，對家蠶的急性毒性為“低毒”，結(jié)果與新奧霉素 (xinaomycin) 對家蠶的急性毒性一致[33]，但同為大環(huán)內(nèi)脂類抗生素的阿維菌素對家蠶的急性毒性卻表現(xiàn)為 “劇毒”[32]，這可能與二者的防治對象差異有關(guān)。近年來，有關(guān)農(nóng)藥對家蠶的慢性毒性也逐漸引起了人們的關(guān)注，慢性毒性雖不足以導致家蠶短時間內(nèi)中毒死亡，但隨著攝入量的積累，會對家蠶生長發(fā)育、生理代謝和經(jīng)濟性狀如眠蠶體重、全繭量、繭層量、繭層率、結(jié)繭率和化蛹率等產(chǎn)生影響[34-35]。本研究中觀察發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可使家蠶的發(fā)育歷期延長，但并未對其經(jīng)濟學性狀進行評價，后續(xù)還需進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性為 “中毒”，急性接觸毒性為 “低毒”，與張寶蘭等[36]發(fā)現(xiàn)阿維菌素對意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性為 “高毒” 存在一定差異，其原因可能也與二者的防治對象不同有關(guān)。賈偉等[37]研究發(fā)現(xiàn)，相同有效成分、不同劑型的農(nóng)藥對斑馬魚的毒性不同，嘧菌酯 (azoxystrobin) 原藥的急性毒性大于水分散粒劑，啶氧菌酯 (picoxystrobin) 懸浮劑的急性毒性大于原藥，這可能與制劑中的助劑及溶劑有關(guān)。本研究中采用二甲基亞砜作助溶劑，發(fā)現(xiàn)其對斑馬魚無影響，觀察發(fā)現(xiàn)，斑馬魚在高濃度雷帕霉素中反應較為迅速，隨著染毒時間延長，出現(xiàn)腹部腫大、魚鰭張開、腮部淤血等中毒癥狀。蚯蚓對環(huán)境變化較為敏感，且對有機及無機污染物具有富集作用，常作為模式生物用于研究土壤生態(tài)環(huán)境變化。經(jīng)高濃度雷帕霉素處理后，赤子愛勝蚯蚓出現(xiàn)黃色體液滲出、局部腫大潰爛、環(huán)帶膨大等中毒癥狀，低濃度處理組則中毒癥狀不明顯。本研究表明，雷帕霉素對赤子愛勝蚯蚓為 “低毒”，這與阿維菌素、伊維菌素對赤子愛勝蚯蚓的急性毒性結(jié)果一致[38]。

綜上所述，雷帕霉素屬于易降解性藥劑，因此在今后的劑型開發(fā)中應以可控釋、緩釋的微膠囊等制劑為主；雷帕霉素對斑馬魚和意大利工蜂的急性經(jīng)口毒性為 “中毒”，在藥劑施用時應盡量遠離河道和避開花期。雖然目前雷帕霉素尚未作為商品農(nóng)藥使用，但大量文獻研究結(jié)果[11-16]表明，其作為一種生物源農(nóng)藥開發(fā)的潛力巨大。開展雷帕霉素的水解行為和對非靶標生物的毒性研究將有助于更好地了解其在水體中的降解行為、環(huán)境歸趨和對非靶標生物的安全性，為雷帕霉素藥劑的合理開發(fā)及安全使用提供重要參考。