井岡羥胺A 酯類衍生物的酶法合成及其生物活性

葉 康, 江瑞妮, 蒼 濤, 陸躍樂, 陳小龍, 范永仙

(1. 浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，杭州 310014；2. 浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310014；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，杭州 310021)

井岡霉素 (validamycin) 是由吸水鏈霉菌井岡變種合成的一類農(nóng)用抗生素[1]，包括A、B、C、D、E、F、G 和H 共8 個(gè)組分，具有低毒、高效、廉價(jià)等優(yōu)勢，被廣泛用于水稻紋枯病的防治[2]。井岡羥胺A (validoxylamine A) 作為井岡霉素A 中的活性結(jié)構(gòu)單元，具有抑菌、殺蟲活性[3]，是重要的生物農(nóng)藥中間體[4](圖式1)。

研究表明，井岡羥胺A 作為一種競爭性的海藻糖酶抑制劑，能夠高效抑制海藻糖的水解，阻斷生物體內(nèi)的能量代謝，達(dá)到抑制病蟲害的效果[5]。然而，盡管在離體試驗(yàn)中井岡羥胺A 對海藻糖酶表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制活性[6-7]，但是由于其含多個(gè)羥基結(jié)構(gòu)，而生物體對井岡羥胺A 的吸收效果較差，所以在活體實(shí)驗(yàn)中未能表現(xiàn)出應(yīng)有的生物活性[8]。因此，如何提高井岡羥胺A 對昆蟲表皮的透皮作用成為研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。鄭鹛[9]合成了菊酰基井岡羥胺A 化合物，其在500 mg/L 下對苜蓿蚜蟲死亡率達(dá)96.7%。鄭輝[10]通過化學(xué)法構(gòu)建了多種井岡羥胺A 衍生物的化合物庫，在一定程度上拓寬了井岡羥胺A 的應(yīng)用范圍。

酯化反應(yīng)是常見的用于改變化合物極性的藥物設(shè)計(jì)手段，但井岡羥胺A 的多羥基結(jié)構(gòu)加大了其通過化學(xué)方法進(jìn)行酯化修飾的難度。與井岡羥胺A 結(jié)構(gòu)類似的糖類化合物，在經(jīng)脂肪酶Novozym 435 酯化合成糖酯后，已廣泛用于食品、化妝品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域[11]。由于在傳統(tǒng)的化學(xué)酯化過程中，極易產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，因此需要涉及羥基的保護(hù)/脫保護(hù)等復(fù)雜步驟[12-13]，而脂肪酶催化的酯化反應(yīng)具有高度的選擇性，能在溫和的條件下一步合成單一位點(diǎn)的酯化產(chǎn)物[14-16]，并且現(xiàn)有的固定化技術(shù)不僅能夠有效提高脂肪酶在有機(jī)溶劑中的耐受性，而且固定化脂肪酶還能夠回收再利用，降低了使用成本[15,17]。鑒于此，本研究以井岡羥胺A 為先導(dǎo)化合物，利用脂肪酶Novozym 435將不同的有機(jī)酸引入井岡羥胺A 分子中，設(shè)計(jì)合成了9 個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的井岡羥胺A 酯類衍生物(圖式2)，并測定了其對立枯絲核菌、油菜菌核病菌以及豆蚜的生物活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance Ⅲ 500 MHz 核磁共振儀 (以DMSO-d6或者M(jìn)ethanol-d4為溶劑，TMS 作為內(nèi)標(biāo))。薄層層析硅膠板 (GF 254 型) 購自青島海洋化工；柱層析硅膠 (300～400 目，粒度為40～45 μm)購自阿拉丁 (上海) 試劑有限公司；脂肪酶Novozym 435 購自北京高瑞森科技有限公司；全部試劑均為市售分析純。

1.2 目標(biāo)化合物合成

將8 g 井岡羥胺A 加入500 mL 叔丁醇中，100 ℃下回流5 h，得到井岡羥胺A-叔丁醇飽和溶液，備用。在單口圓底燒瓶中，依次加入井岡羥胺A-叔丁醇飽和溶液21 mL (含井岡羥胺A 0.5 mmol)、有機(jī)酸2 mmol、Novozym 435 脂肪酶60 mg 和4?分子篩600 mg，于60 ℃恒溫磁力攪拌水浴鍋中反應(yīng)。24 h 后補(bǔ)加井岡羥胺A 固體170 mg (0.5 mmol)，繼續(xù)反應(yīng)24 h，采用薄層色譜(TLC，V(正丙醇)：V(乙酸) :V(水) = 4 : 1 : 1) 監(jiān)控至反應(yīng)終點(diǎn)。過濾，減壓脫去溶劑，用10 mL正丁醇萃取，再用飽和氯化鈉洗滌，保留有機(jī)相，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，硅膠柱層析 (V(正丙醇) :V(乙酸) = 8 : 1) 純化，減壓脫去溶劑并干燥后得到井岡羥胺A 酯類衍生物。

9 種新型衍生物的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、13C NMR和HRMS 驗(yàn)證，相關(guān)數(shù)據(jù)如下。

井岡羥胺A 芥酸酯 (Ⅰ)：淡黃色油狀液體，收率42%。1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ: 5.98 (d,J= 13.7 Hz,1H), 5.36 (t,J= 4.9 Hz, 2H), 4.81 (d,J= 12.9 Hz, 1H), 4.61(d,J= 13.0 Hz, 2H), 4.21 (p,J= 14.4, 12.8 Hz, 3H), 3.99 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 3.70 (s, 1H), 3.67 - 3.58 (m, 3H), 3.46 (d,J=15.1 Hz, 2H), 3.33 (d,J= 1.7 Hz, 3H), 3.27 (d,J= 8.8 Hz,1H), 2.40 - 2.32 (m, 2H), 2.12 (s, 1H), 2.09 - 2.03 (m, 4H),2.03 (s, 1H), 1.66 - 1.60 (m, 2H), 1.38 - 1.28 (m, 32H), 0.92(t,J= 6.8 Hz, 3H)。13C NMR (126 MHz, Methanol-d4),δ:175.70, 140.51, 140.84, 125.12, 75.02, 74.43, 74.12, 72.73,72.36, 70.74, 65.91, 63.33, 56.27, 54.83, 37.75, 33.04, 31.26,30.81, 30.72, 30.61, 30.58, 30.42, 30.31, 30.29, 30.24, 28.10,26.08, 26.04, 26.03, 22.57, 14.47。HRMS:C36H65NO9[M+H]+，測試值656.470 0，計(jì)算值656.469 3。

井岡羥胺A 對氟苯乙酸酯 (Ⅱ)：淡黃色油狀液體，收率34%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 7.31 (dd,J= 8.4,5.5 Hz, 2H), 7.13 (t,J= 8.8 Hz, 2H), 5.75 (d,J= 4.1 Hz, 1H),4.20 (d,J= 3.1 Hz, 1H), 4.18 (d,J= 3.0 Hz, 1H), 4.00 (s, 1H),3.98 (s, 1H), 3.96 - 3.96 (m, 2H), 3.95 (s, 2H), 3.91 (s, 2H),3.74 (d,J= 5.9 Hz, 2H), 3.66 (s, 2H), 3.43 - 3.32 (m, 4H),3.26 - 3.22 (m, 1H), 3.08 - 3.01 (m, 2H), 2.99 - 2.92 (m, 1H),1.99 - 1.92 (m, 1H), 1.75 - 1.66 (m, 1H), 1.02 (t,J= 13.4 Hz,1H)。13C NMR (126 MHz, DMSO-d6),δ: 171.19, 160.29 (d,J= 242.6 Hz), 140.72, 131.46 (d,J= 8.1 Hz), 130.78, 120.00,114.99 (d,J= 20.8 Hz), 74.61, 73.39, 72.61, 71.61, 71.11,70.18, 65.47, 61.45, 54.10, 52.09, 38.40, 35.97, 27.52。HRMS:C22H30FNO9[M+H]+，測試值472.197 9，計(jì)算值472.197 7。

井岡羥胺A 對氯苯乙酸酯 (Ⅲ)：淡黃色油狀液體，收率39%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 7.40 - 7.34 (m,2H), 7.33 - 7.28 (m, 2H), 5.74 (dd,J= 15.2, 4.0 Hz, 1H), 4.68(d,J= 13.3 Hz, 1H), 4.61 - 4.54 (m, 2H), 4.50 (s, 3H), 4.20(dd,J= 10.7, 3.1 Hz, 2H), 3.99 (t,J= 8.0 Hz, 2H), 3.74 (d,J=9.5 Hz, 1H), 3.68 (s, 1H), 3.48 (dd,J= 10.4, 3.7 Hz, 1H), 3.45 -3.38 (m, 2H), 3.35 (td,J= 9.1, 8.7, 3.9 Hz, 2H), 3.28 - 3.22(m, 1H), 3.12 (s, 1H), 3.05 (s, 1H), 3.01 (d,J= 9.2 Hz, 1H),2.96 (d,J= 9.3 Hz, 1H), 1.97 (s, 1H), 1.71 (dd,J= 10.9, 3.6 Hz,1H), 1.06 (dt,J= 13.4 Hz, 1H)。13C NMR (126 MHz, DMSOd6),δ: 170.87, 140.68, 135.07, 131.51, 128.28, 119.85, 74.57,73.33, 72.65, 70.58, 70.16, 70.07, 65.52, 61.40, 54.05, 52.04,38.40, 35.90, 27.48。HRMS:C22H30ClNO9[M+H]+，測試值488.167 7，計(jì)算值488.168 2。

井岡羥胺A3-苯丙酸酯 (Ⅳ)：黃色油狀液體，收率26%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 7.27 (t,J= 7.5 Hz,2H), 7.21 (d,J= 7.6 Hz, 2H), 7.18 (t,J= 7.3 Hz, 1H), 5.78 (d,J= 4.5 Hz, 1H), 4.72 - 4.34 (m, 8H), 4.18 (dd,J= 10.9,3.1 Hz, 1H), 4.00 (d,J= 6.2 Hz, 1H), 4.00 - 3.95 (m, 2H),3.74 (d,J= 6.3 Hz, 1H), 3.43 (dd,J= 8.9, 5.7 Hz, 1H), 3.38 (t,J= 4.2 Hz, 1H), 3.36 (d,J= 9.0 Hz, 1H), 3.27 (dd,J= 9.4,4.4 Hz, 1H), 3.12 (d,J= 4.7 Hz, 1H), 3.06 (q,J= 4.2, 3.7 Hz,1H), 3.00 (t,J= 9.7 Hz, 1H), 2.85 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 2.61 (t,J= 7.6 Hz, 2H), 1.98 (tdt,J= 10.2, 6.8, 4.0 Hz, 1H), 1.70 (dt,J= 14.4, 3.5 Hz, 1H), 1.04 - 0.98 (m, 1H).13C NMR (126 MHz,DMSO-d6),δ: 172.75, 141.05, 141.00, 128.77, 128.65, 126.49,120.32, 75.07, 73.75, 73.70, 73.06, 71.45, 70.60, 65.33, 61.86,54.62, 52.58, 36.33, 35.59, 30.76, 27.91. HRMS: C23H33NO9[M+H]+，測試值498.268 1，計(jì)算值498.268 8。

井岡羥胺A 肉桂酸酯 (Ⅴ)：黃色油狀液體，收率33%。1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ: 7.69 (dd,J=16.0, 7.1 Hz, 1H), 7.58 (dd,J= 6.2, 2.8 Hz, 2H), 7.38 (dd,J=4.6, 2.2 Hz, 3H), 6.53 ((d, J = 5.0 Hz, 1H), 5.94 (d,J= 4.4 Hz,1H), 4.90 (s, 1H), 4.85 (s, 1H), 4.36 - 4.25 (m, 1H), 4.18 (d,J= 14.1 Hz, 1H), 4.12 (d,J= 14.1 Hz, 1H), 3.97 (d, J = 5.8 Hz,1H), 3.66 (d,J= 6.8 Hz, 1H), 3.64 (d,J= 5.6 Hz, 1H), 3.61 (d,J= 3.4 Hz, 1H), 3.59 (d,J= 9.1 Hz, 1H), 3.57 (d,J= 5.3 Hz,1H), 3.56 (d,J= 6.0 Hz, 1H), 3.54 (d,J= 9.2 Hz, 1H), 3.48(dd,J= 9.8, 4.1 Hz, 1H), 3.42 (d,J= 4.3 Hz, 1H), 3.32 (s, 2H),3.31 - 3.29 (m, 1H), 3.26 (s, 1H), 3.23 (t,J= 9.3 Hz, 1H), 2.17(s, 1H), 2.04 - 1.99 (m, 1H), 1.85 (d,J= 6.1 Hz, 1H)。13C NMR (126 MHz, Methanol-d4),δ: 177.21, 145.19, 141.16,134.35, 130.17, 124.27, 117.43, 75.00, 74.56, 73.26, 72.92,71.42, 70.12, 64.95, 61.12, 54.99, 53.39, 38.51, 27.29。HRMS: C23H31NO9[M+H]+，測試值466.206 9，計(jì)算值466.206 2。

井岡羥胺A 水楊酸酯 (Ⅵ)：黃色油狀液體，收率14%。1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ: 7.86 (s, 1H), 7.44(s, 1H), 6.89 (dd,J= 7.2, 3.8 Hz, 1H), 6.87 - 6.84 (m, 1H),5.93 (d,J= 14.7 Hz, 1H), 4.68 (s, 1H), 4.56 (s, 1H), 4.45 (s,2H), 4.23 (d,J= 5.1 Hz, 1H), 4.16 (s, 1H), 4.14 (m, 1H), 4.10(s, 1H), 4.02 (s, 1H), 3.93 (dJ= 4.9 Hz, 2H), 3.83 (s, 1H), 3.64 -3.61 (m, 2H), 3.58 (s, 2H), 3.52 (s, 1H), 3.45 (d,J= 6.7 Hz,2H), 3.04 (s, 1H), 2.24 - 2.19 (m, 1H), 1.80 (s, 2H), 1.51 -1.47 (m, 1H)。13C NMR (126 MHz, Methanol-d4),δ: 170.23,164.06, 141.65, 134.19, 133.24, 126.13, 119.02, 112.90,112.49, 73.68, 73.47, 73.09, 71.14 70.05, 69.78, 65.72, 61.84,56.11, 55.93, 37.07, 25.75。HRMS: C21H29NO10[M+H]+，測試值456.186 0，計(jì)算值456.186 4。

井岡羥胺A 阿魏酸酯 (Ⅶ)：黃色油狀液體，收率12%。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6),δ: 7.69 (d,J= 14.2 Hz,1H), 7.22 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.95 - 6.88 (m, 1H), 6.87 -6.76 (m, 1H), 6.41 (d,J= 12.5 Hz, 1H), 6.01 - 5.95 (m, 1H),4.77 (d,J= 7.3 Hz, 1H), 4.74 (d,J= 12.1 Hz, 1H), 4.72 - 4.69(m, 1H), 4.36 - 4.30 (m, 1H), 4.29 - 4.25 (m, 1H), 4.21 (s,1H), 4.19 (s, 1H), 4.13 (s, 1H), 4.03 (s, 1H), 4.00 (s, 1H), 3.96(s, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.70 (s, 2H), 3.65 - 3.60 (m, 2H), 3.57 (s,1H), 3.52 (s, 1H), 3.51 (s, 1H), 3.05 (s, 1H), 2.25 - 2.17 (m,1H), 1.88 (s, 1H), 1.64 (s, 1H)。13C NMR (126 MHz,Methanol-d4),δ: 177.36, 147.11, 145.55, 144.14, 140.29,127.19, 125.73, 124.87, 120.03, 115.06, 75.14, 73.68, 73.13,71.57, 71.01, 69,89, 63.32, 61.92, 55.36, 55.08, 52.87, 38.52,25.24。HRMS: C24H33NO11[M+H]+，測試值512.213 1，計(jì)算值512.212 6。

井岡羥胺A11-馬來酰亞胺十一酸酯 (Ⅷ)：褐色油狀液體，收率52%。1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ: 6.14 -5.75 (m, 1H), 4.82 - 4.71 (m, 1H), 4.59 (s, 1H), 4.51 (s, 1H),4.29 (t,J= 6.7 Hz, 1H), 4.19 (s, 1H), 4.18 - 4.07 (m, 2H), 4.02(q,J= 7.0 Hz, 1H), 3.99 - 3.93 (m, 1H), 3.91 - 3.84 (m, 1H),3.78 (s, 1H), 3.70 - 3.61 (m, 2H), 3.61 - 3.57 (m, 2H), 3.50 (s,1H), 3.48 - 3.47 (m, 2H), 3.35 - 3.22 (m, 3H), 3.05 - 2.94 (m,1H), 2.66 - 2.50 (m, 4H), 2.40 - 2.21 (m, 2H), 2.16 - 2.01 (m,1H), 1.92 (s, 1H), 1.65 - 1.52 (m, 5H), 1.33 - 1.23 (m, 12H)。13C NMR (126 MHz, Methanol-d4),δ: 177.08, 173.55, 141.25,124.61, 75.03, 73.80, 73.13, 71.55, 71.08, 70.65, 65.28, 64.36,54.67, 52.68, 38.99, 37.52, 34.08, 29.11, 28.93, 28.71, 28.15,28.03, 24.96, 24.93。HRMS: C29H48N2O11[M+H]+，測試值601.329 4，計(jì)算值601.329 2。

井岡羥胺A 環(huán)丙烷羧酸酯 (Ⅸ)：淡黃色油狀液體，收率48%。1H NMR (500 MHz, Methanol-d4),δ: 5.73 (m, 1H),4.63 (dd,J= 9.2, 6.2 Hz, 2H), 4.56 (d,J= 5.9 Hz, 1H), 4.36(d,J= 5.5 Hz, 1H), 4.27 - 4.19 (m, 3H), 4.19 - 4.05 (m, 3H),4.00 (s 1H), 3.96 - 3.87 (m, 1H), 3.72 - 3.60 (m, 4H), 3.59 -3.43 (m, 3H), 3.08 - 2.98 (m, 1H), 2.20 (d,J=6.4 Hz, 1H),1.97 - 1.84 (m, 2H), 1.66 (d,J= 3.9 Hz, 1H), 1.14 - 1.01 (m,2H), 1.01 - 0.89 (m, 2H)。13C NMR (126 MHz, Methanol-d4),δ: 173.61, 141.93, 125.11, 74.89, 74.50, 74.16, 73.92, 72.30,71.03, 67.99, 63.96, 56.68, 55.33, 37.25, 25.71, 13.24, 9.36。HRMS: C18H29NO9[M+H]+，測試值404.185 1，計(jì)算值404.185 6。

1.3 生物活性測試

1.3.1 抑菌活性 立枯絲核菌Rhizoctonia solani和油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum，分別由浙江大學(xué)和浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

采用菌絲生長速率法[18]測定化合物Ⅰ ～Ⅸ 對植物病原真菌的抑制活性，藥劑質(zhì)量濃度為200、100、50、25、12.5 和6.25 μmol/L。將目標(biāo)化合物用5 mL 含0.1% Tween-80 的無菌水溶解，加入熱培養(yǎng)基中，配制成含藥培養(yǎng)基。在含藥培養(yǎng)基上接入菌餅，每個(gè)藥劑設(shè)置3 次重復(fù)。置于生化培養(yǎng)箱 (溫度23 ℃) 中培養(yǎng)，待空白對照菌落長至培養(yǎng)皿2/3 直徑時(shí)，測定處理組菌落直徑，并按 (1)式計(jì)算抑制率。采用SPSS 軟件計(jì)算EC50值和95%置信區(qū)間。

式中：I—菌絲生長抑制率，%；D0—空白對照菌落直徑，mm；Dt—藥劑處理菌落直徑，mm。

1.3.2 殺蟲活性 豆蚜Aphis craccivora，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

采用浸葉法[19]測定目標(biāo)化合物對豆蚜的殺蟲活性。準(zhǔn)確稱取待測化合物50 mg，用正丙醇溶解并配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L 的藥液。將感染蚜蟲的蠶豆葉片浸入藥液中10 s，取出懸掛10～20 min 風(fēng)干水分后，置于帶有濕濾紙片的培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。于23～25 ℃室內(nèi)培養(yǎng)，相對濕度65%，24 h 后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。以井岡羥胺A 與井岡霉素A 為陽性對照，正丙醇為陰性對照，另設(shè)空白對照 (CK)。以毛筆撥動蟲體無反應(yīng)記為死亡，當(dāng)CK 死亡率大于10%時(shí)判定試驗(yàn)無效。

分別按 (2)、(3) 式計(jì)算死亡率 (M) 和校正死亡率 (Ma)。

式中：N1—豆蚜死亡數(shù)；N2—豆蚜總數(shù)；M1—施藥組死亡率，%；M2—空白組死亡率，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的合成

在合成化合物之前，通過制備井岡羥胺A-叔丁醇飽和溶液將反應(yīng)液中井岡羥胺A 的質(zhì)量濃度由5.5 g/L 提高至8.2 g/L，有利于提高酶催化反應(yīng)速率。有研究表明，在脂肪酶催化糖酯合成研究中，提高?；w的濃度能夠促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行[20-21]。Yan 等[22]研究了糖酯合成過程中底物物質(zhì)的量之比對產(chǎn)率的影響，發(fā)現(xiàn)過量的?；w對提高糖酯的產(chǎn)率有較大作用。本研究通過對多個(gè)反應(yīng)條件的探索，最終確定反應(yīng)溫度為60 ℃，底物n(井岡羥胺A) :n(有機(jī)酸) = 1 : 4，分子篩質(zhì)量濃度為30 g/L，脂肪酶質(zhì)量濃度為3 g/L。當(dāng)以酚酸作為?；w時(shí)，反應(yīng)時(shí)間需延長至7 d 后才檢測到少量產(chǎn)物的生成，這與文獻(xiàn)報(bào)道的由Novozym 435 催化水楊酸酯的合成效率相似[23-25]，可能是由于水楊酸苯環(huán)上的羥基對脂肪酶具有一定抑制效應(yīng)[26]。Novozym 435 作為催化劑在合成多元醇酯化物時(shí)具有區(qū)域選擇性。例如：在催化合成海藻糖二酯時(shí)，其酯化位點(diǎn)在兩個(gè)伯羥基[27]，在催化葡萄糖與脂肪酸的酯化反應(yīng)中，其酯化位點(diǎn)同樣在6 位的伯羥基[28-29]。本研究以Novozym 435 為催化劑合成井岡羥胺A 酯類衍生物，反應(yīng)過程簡單，選擇性高，產(chǎn)物單一有利于分離純化，并且反應(yīng)用到的脂肪酶、分子篩、叔丁醇均能夠回收再利用，符合可持續(xù)發(fā)展理念。

2.2 化合物的核磁數(shù)據(jù)分析

以目標(biāo)化合物 Ⅳ 的結(jié)構(gòu) (圖式3) 為例。其與井岡羥胺A 的1H NMR 譜及13C NMR 譜的信號歸屬如表1 所示。高分辨質(zhì)譜顯示分子中只增加了一個(gè)?；f明產(chǎn)物為井岡羥胺A 的一?；a(chǎn)物；通過比較原料和產(chǎn)物的1H NMR 譜發(fā)現(xiàn)，酯化后井岡羥胺A 在δ1.70 處的多重峰向低場移動至δ2.00，這是5 位質(zhì)子受吸電子基團(tuán)的誘導(dǎo)效應(yīng)所致，而比較13C NMR 譜發(fā)現(xiàn)，井岡羥胺A 中δ63.06 向低場移動至δ65.33，這是7 位碳受吸電子基團(tuán)的誘導(dǎo)效應(yīng)所致，δ38.86 向高場移動至δ36.33，這是6 位碳受γ-效應(yīng)所致。根據(jù)這些結(jié)果初步說明酶催化酯化反應(yīng)區(qū)域選擇性發(fā)生在7 位。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，7 位伯碳上質(zhì)子的化學(xué)位移向低場移動到δ4.18 和4.00。化合物IV 的二維譜圖遠(yuǎn)程異核化學(xué)位移相關(guān)譜 (HMBC，圖1) 顯示，7 位伯碳上的質(zhì)子 (δ4.18 和4.00) 與δ172.75的羰基碳存在遠(yuǎn)程相關(guān)，因此，確定井岡羥胺A 酯化物的酯化位點(diǎn)發(fā)生在7 位伯羥基。

表1 化合物 Ⅳ 與井岡羥胺A 的核磁數(shù)據(jù)分析Table 1 NMR data analysis of compound Ⅳ and validoxylamine A

2.3 對立枯絲核菌和油菜菌核病菌的抑菌活性

目標(biāo)化合物對立枯絲核菌的抑制作用見表2。除化合物 Ⅱ、Ⅳ、Ⅸ 外，其余化合物在200 μmol/L下對立枯絲核菌的抑制率均大于50%，其中化合物Ⅰ和 Ⅲ 的抑制率分別為71.22%和73.48%。在測定化合物的EC50值時(shí)發(fā)現(xiàn)，化合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅷ表現(xiàn)出優(yōu)于先導(dǎo)化合物井岡羥胺A 的抑菌活性。初步構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)果表明：直鏈有機(jī)酸作為?；w有利于提高目標(biāo)化合物的抑菌活性，尤其是低濃度下還能保持較高的抑菌活性 (EC50值：井岡霉素A ＜ Ⅰ ＜ Ⅷ ＜ Ⅲ ＜ 井岡羥胺A ＜ Ⅴ ＜ Ⅵ ＜Ⅱ ＜ Ⅶ ＜ Ⅸ ＜ Ⅳ)；苯環(huán)上取代基的電負(fù)性增強(qiáng)有利于提高化合物的抑菌活性 (EC50值：Ⅱ ＜ Ⅲ)，推測是由于鹵素作為親脂基團(tuán)，能夠改善膜透過性，從而增強(qiáng)了化合物的抑菌活性[30]；此外，烷烴鏈上的雙鍵對化合物的抑菌活性具有促進(jìn)作用(EC50值：Ⅴ ＜ Ⅳ)。

表2 井岡羥胺A 酯類衍生物對立枯絲核菌的抑制作用及EC50 值Table 2 Inhibition and EC50 values of validoxylamine A ester derivatives on R. solani

目標(biāo)化合物對油菜菌核病菌的抑制活性如圖2所示。在200 μmol/L 下，先導(dǎo)化合物井岡羥胺A并未表現(xiàn)出較高的抑制活性，而通過酯化反應(yīng)引入不同?；w的衍生物卻有部分表現(xiàn)出了更強(qiáng)的抑菌活性，如目標(biāo)化合物 Ⅲ、Ⅷ 對油菜菌核病菌的抑制率比井岡霉素A 提高了1.5 倍。表明通過對井岡羥胺A 進(jìn)行衍生化反應(yīng)，能夠拓寬其抗菌譜，有利于開發(fā)以井岡羥胺A 為先導(dǎo)化合物的殺菌劑。

2.4 對豆蚜的殺蟲活性

如圖3 所示，在500 mg/L 下，井岡羥胺A 與井岡霉素A 對豆蚜的校正死亡率分別為7.71%和32.74%，除了目標(biāo)化合物Ⅰ和 Ⅸ外，其余化合物的殺蟲活性相對于井岡羥胺A 都得到了提高，其中化合物 Ⅶ 的校正死亡率最高，為64.60%。

初步構(gòu)效關(guān)系研究表明，當(dāng)以碳鏈長度過大的有機(jī)酸 (化合物Ⅰ) 作為?；w時(shí)，由于空間位阻增大，削弱了相應(yīng)衍生物的殺蟲活性，而烷基鏈上的雙鍵對衍生物的殺蟲活性具有促進(jìn)作用(校正死亡率：Ⅳ ＜ Ⅴ)；此外，苯環(huán)上鹵素的電負(fù)性越強(qiáng)，殺蟲活性越弱；甲氧基團(tuán) (化合物 Ⅶ) 對酯化產(chǎn)物的殺蟲活性有著顯著的增強(qiáng)作用。

3 結(jié)論

井岡羥胺A 為生物農(nóng)藥活性中心，利用脂肪酶法可選擇性地對其進(jìn)行酯化，獲得系列新型化合物。本研究以井岡羥胺A 為先導(dǎo)化合物，經(jīng)脂肪酶催化合成了9 種未見文獻(xiàn)報(bào)道的井岡羥胺A酯類衍生物。抑菌活性研究表明，所有化合物對立枯絲核菌都表現(xiàn)出一定的抑制活性，其中化合物物Ⅰ、Ⅲ、Ⅷ 的EC50值分別為13.03、34.62和27.69 μmol/L，并且化合物 Ⅲ和 Ⅷ 在200 μmol/L下對油菜菌核病菌的抑制率分別為29.88% 和28.71%，優(yōu)于井岡羥胺A。此外，對井岡羥胺A的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，還能增強(qiáng)其對蚜蟲的殺蟲活性，目標(biāo)化合物 Ⅶ 在500 mg/L 下對蚜蟲的致死率為64.60%。本研究為新型井岡羥胺A 酯類衍生物的設(shè)計(jì)和構(gòu)效關(guān)系提供了新思路。