褪黑素對年齡相關(guān)性黃斑變性模型小鼠視網(wǎng)膜氧化損傷的保護(hù)機(jī)制研究

董偉華，魏抗抗，帖紅艷，何章彪，趙琳

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是一種與年齡有關(guān)的致盲性退行性眼底疾病，隨著人口老齡化加劇，發(fā)病人數(shù)逐年增加［1］。AMD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelium，RPE）變性造成視網(wǎng)膜感受器細(xì)胞退化，是導(dǎo)致視覺受損的一個因素，影響RPE 變性的機(jī)制可能有炎癥、氧化應(yīng)激和線粒體功能紊亂等［2］。碘酸鈉（NaIO3）是強(qiáng)氧化劑，可作為視網(wǎng)膜毒素，造成RPE損傷，因此可用于誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變復(fù)制干性AMD。褪黑素（melatonin，MEL）作為抗氧化劑能夠清除氧自由基，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加抗氧化酶的表達(dá)［3］。MEL在視網(wǎng)膜中可以清掃羥基自由基，保護(hù)色素上皮免受氧化損傷，但在AMD 中水平降低［4］。目前尚不明確增加MEL的表達(dá)能否減輕AMD癥狀，相關(guān)的動物模型研究也較少。沉默信息調(diào)節(jié)因子1/叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子1（silent mating type information regulation 2 homolog 1/forkhead box transcription factor O1，SIRT1/FOXO1）通路具有調(diào)控氧化應(yīng)激作用［5］。MEL可以激活SIRT1/FOXO1通路發(fā)揮作用［6］，而MEL在AMD中是否通過影響SIRT1/FOXO1 通路發(fā)揮作用目前尚不清楚。本研究通過NaIO3誘導(dǎo)建立 AMD 小鼠模型，探討MEL 對 AMD的影響及作用機(jī)制，為治療AMD 提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 NaIO3粉末（武漢沃弗化工有限公司）；MEL（西安拉維亞生物科技有限公司，CAS登陸號73-31-4，純度99%）；熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H44023401）；HE 染色試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒，一抗SIRT1（兔源）、FOXO1（兔源）及山羊抗兔二抗均購自英國abcam 公司；一抗Ac-FOXO1（兔源）購自英國Abbkine公司。眼底熒光造影儀（日本ITO公司，型號：TRC-50DX）；蛋白凝膠成像系統(tǒng)（上海Tanon公司，型號：Tanon4600）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 90只SPF級雄性BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011，7 周齡，體質(zhì)量（20±2）g。飼養(yǎng)條件：溫度（23±1）℃、濕度（50±5）%，自然光照，自由飲水飲食。所有實(shí)驗(yàn)過程符合3R 原則，本研究經(jīng)商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校動物倫理委員會審核并批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 動物造模與分組 實(shí)驗(yàn)前所有小鼠經(jīng)眼科裂隙燈下檢查均未發(fā)現(xiàn)眼部異常。90 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，模型組及MEL 低、中、高劑量組，每組18 只。NaIO3粉末用生理鹽水溶解，制成20 g/L溶液，4 ℃冰箱暫存。除正常組外的各組小鼠參照文獻(xiàn)［7］尾靜脈注射25 μL/g NaIO3，注射完成后將小鼠放置安靜、潔凈、溫暖環(huán)境中直至蘇醒再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；正常組小鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水。小鼠蘇醒后MEL 低、中、高劑量組分別以10、20、40 mg/kg MEL 灌胃，MEL 溶于生理鹽水中配制成固定1 mL 溶液灌胃；正常組、模型組灌胃等體積生理鹽水，1次/d，持續(xù)1周。

1.3.2 樣品收集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有小鼠眼眶靜脈取血，多次采血，取300～400 μL。室溫靜置2 h，1 000 r/min離心10 min，取上清液待用。每組采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取6只觀察眼底情況；6只摘除眼球，置于4%多聚甲醛中固定保存；剩余6只摘除眼球，分離出視網(wǎng)膜，置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 眼底熒光造影儀檢測 小鼠散瞳，10%熒光素鈉注射液（2 mL/kg）腹腔注射，待熒光素鈉循環(huán)至眼底，眼底熒光造影儀對小鼠右眼行熒光素眼底血管造影（FFA）；FFA 檢查后行光學(xué)相干斷層掃描（OCT），再行眼底照相。由兩位操作熟練的眼科工作者測量視網(wǎng)膜厚度。

1.3.4 HE染色檢測視網(wǎng)膜形態(tài) 4%多聚甲醛固定眼球后，經(jīng)石蠟固定包埋，平行眼軸方向連續(xù)切片，厚度5 μm。視網(wǎng)膜切片蘇木素染色，蒸餾水沖洗，滴加伊紅染液復(fù)染。經(jīng)二甲苯透明，中性樹膠封片后，光學(xué)顯微鏡（×200）觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)。

1.3.5 眼眶靜脈血SOD、GSH-Px、CAT 活性檢測 分別在550、405、412 nm 波長處采用試劑盒檢測血清中SOD、GSHPx、CAT的光密度（OD）值，計算對應(yīng)酶活性。

1.3.6 Western blot 檢測小鼠視網(wǎng)膜中 SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1 蛋白水平 視網(wǎng)膜中添加蛋白裂解液冰上研磨，10 000 r/min，4 ℃離心20 min，上清為總蛋白。BCA試劑盒測蛋白濃度，每孔上樣20 ng，經(jīng)凝膠電泳分離、PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h，添加一抗 SIRT1（1∶1 000）、FOXO1（1∶2 000）、Ac-FOXO1（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃孵育過夜；洗膜后添加山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，DAB顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)拍照和定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MEL 對小鼠眼底影響 正常組小鼠視網(wǎng)膜血管自視盤向周圍發(fā)出均勻的大血管，分支良好且延伸到視網(wǎng)膜周圍；模型組視盤消失，血管出現(xiàn)收縮現(xiàn)象，視網(wǎng)膜變白。隨著MEL 劑量的升高，逐漸顯示出視盤，視網(wǎng)膜恢復(fù)。見圖1。

2.2 MEL 對小鼠眼底FFA 影響 正常組熒光均勻分布于血管內(nèi)；模型組血管出現(xiàn)破裂，熒光出現(xiàn)滲漏現(xiàn)象；隨著MEL 劑量的升高，熒光滲漏現(xiàn)象逐漸緩解。見圖2。

Fig.1 Color photographs of the fundus in 5 groups of mice圖1 5組小鼠眼底彩照視網(wǎng)膜情況

Fig.2 FFA inspection results of 5 groups of mice圖2 5組小鼠FFA檢查結(jié)果

2.3 MEL對小鼠視網(wǎng)膜厚度的影響 正常組、模型組、MEL低劑量組、MEL中劑量組、MEL高劑量組視網(wǎng)膜厚度（μm）分別為 310.16±6.46、220.49±8.48、259.65±8.19、268.16±8.33、298.80±8.17，5 組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=118.196，P＜0.05）。與正常組相比，模型組，MEL 低、中劑量組視網(wǎng)膜厚度降低（P＜0.05）；與模型組相比，MEL 低、中、高劑量組視網(wǎng)膜厚度增加（P＜0.05）；與MEL 低、中劑量組相比，MEL 高劑量組視網(wǎng)膜厚度增加（P＜0.05）。見圖3。

2.4 MEL 對小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)影響 正常組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列整齊且緊密；模型組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列紊亂，外核層排列松散，細(xì)胞嵌入內(nèi)節(jié)段/外節(jié)段（IS/OS），內(nèi)核層（INL）細(xì)胞變大且松散排列，RPE沉積物量增多，細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀。隨著MEL劑量的升高，各層細(xì)胞逐漸排列整齊，外核層（ONL）、INL細(xì)胞緊密排列，RPE沉積物量減少。見圖4。

2.5 MEL 對血清中 SOD、GSH-Px、CAT 活性的影響 與正常組相比，模型組和MEL低、中、高劑量組的血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性降低（P＜0.05）；與模型組相比，MEL 低、中、高劑量組血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性升高（P＜0.05）；與MEL 低劑量組相比，MEL 中劑量組血清中 SOD、GSH-Px 活性升高，MEL 高劑量組血清中 SOD、GSH-Px、CAT 活性升高（P＜0.05）；與MEL 中劑量組相比，MEL 高劑量組血清中SOD、GSH-Px 活性升高（P＜0.05），見表1。

2.6 MEL對視網(wǎng)膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平的影響 5組視網(wǎng)膜中FOXO1蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與正常組相比，模型組，MEL 低、中劑量組視網(wǎng)膜中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平降低，MEL高劑量組視網(wǎng)膜中Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，MEL 低劑量組視網(wǎng)膜中SIRT1 蛋白水平升高（P＜0.05），MEL 中、高劑量組視網(wǎng)膜中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平升高（P＜0.05）；與MEL低、中劑量組相比，MEL高劑量組視網(wǎng)膜中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平升高（P＜0.05）。見表2、圖5。

Fig.3 OCT inspection results of 5 groups of mice圖3 5組小鼠OCT檢查結(jié)果

Fig.4 Retinal morphology of 5 groups of mice(HE staining,×200)圖4 5組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)（HE染色，×200）

Tab.1 Comparison of SOD,GSH-Px and CAT activities in retinal venous blood between the five groups of mice表1 5組小鼠眼眶靜脈血血清中SOD、GSH-Px、CAT活性比較 （n=18，U/mL，）

Tab.1 Comparison of SOD,GSH-Px and CAT activities in retinal venous blood between the five groups of mice表1 5組小鼠眼眶靜脈血血清中SOD、GSH-Px、CAT活性比較 （n=18，U/mL，）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與MEL 低劑量組比較，d與MEL中劑量組比較，P＜0.05

組別正常組模型組MEL低劑量組MEL中劑量組MEL高劑量組F SOD 56.42±5.15 26.37±3.42a 31.58±4.16ab 36.72±4.36abc 51.16±5.02abcd 149.026＊＊GSH-Px 156.85±8.18 75.49±6.47a 102.68±7.10ab 134.12±6.78abc 149.55±7.33abcd 403.428＊＊CAT 10.38±1.85 3.96±0.79a 5.46±0.89ab 6.58±0.52ab 7.18±0.86abc 87.834＊＊

Tab.2 Comparison of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein levels in the retina between the 5 groups of mice表2 5組視網(wǎng)膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平比較 （n=6，）

Tab.2 Comparison of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein levels in the retina between the 5 groups of mice表2 5組視網(wǎng)膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與MEL 低劑量組比較，d與MEL中劑量組比較，P＜0.05

組別正常組模型組MEL低劑量組MEL中劑量組MEL高劑量組F SIRT1 0.21±0.02 0.05±0.01a 0.12±0.02ab 0.14±0.02ab 0.23±0.03bcd 71.591＊＊FOXO1 0.68±0.08 0.59±0.05 0.61±0.09 0.63±0.10 0.68±0.05 1.698 Ac-FOXO1/FOXO1 1.24±0.11 0.12±0.02a 0.19±0.02a 0.23±0.03ab 0.58±0.04abcd 420.526＊＊

Fig.5 SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein levels in retina of 5 groups of mice圖5 5組視網(wǎng)膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平

3 討論

AMD 最大的危害是導(dǎo)致黃斑中心區(qū)視力永久性喪失，已成為中國50歲以上人群眼科疾病的第二病種［8］。濕性AMD 與異常的脈絡(luò)膜新生血管有關(guān)，目前常用治療方法為玻璃體內(nèi)注射血管內(nèi)皮生長因子抗體，通過抑制血管新生達(dá)到治療目的，且效果較好。干性AMD 主要表現(xiàn)為RPE 被大量破壞造成的視損傷，而RPE對于維持血-視網(wǎng)膜屏障、參與視循環(huán)、吞噬脫落細(xì)胞等都具有重要作用［9］。RPE 破壞可造成炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激加劇。NaIO3可特異性作用于RPE，導(dǎo)致RPE 屏障和光感受器細(xì)胞功能遭到破壞，從而引起視網(wǎng)膜感光細(xì)胞、脈絡(luò)膜出現(xiàn)病變，造成視網(wǎng)膜損傷，因此減輕氧化損傷對于疾病治療意義重大［10］。MEL 是脊椎動物松果體的主要分泌物，作為吲哚胺類激素，可起抗氧化、抗凋亡作用［11］，能夠清除活性氧自由基，實(shí)現(xiàn)對氧化損傷的保護(hù)，臨床上可用于治療黃斑變性、青光眼、高血壓、糖尿病等［12］，但在AMD中應(yīng)用缺乏相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組中出現(xiàn)視盤消失、視網(wǎng)膜變白，血管收縮，部分血管出現(xiàn)破裂，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列紊亂、RPE層沉積物量增多，細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀，視網(wǎng)膜損傷嚴(yán)重。MEL 治療后小鼠視盤出現(xiàn)、血管破裂現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，視網(wǎng)膜各層次結(jié)構(gòu)逐漸整齊，且視網(wǎng)膜血管收縮、破裂、視網(wǎng)膜厚度降低現(xiàn)象隨著MEL 劑量的升高逐漸好轉(zhuǎn)，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

SOD 作為自由基清除劑，在機(jī)體自由基的產(chǎn)生和清除中發(fā)揮重要作用；GSH-Px作為催化過氧化氫分解的酶，其水平與氧化損傷、神經(jīng)變性等關(guān)系密切；CAT作為機(jī)體抗氧化系統(tǒng)重要酶，其含量可以評價機(jī)體抗氧化能力，三者均作為自由基清除劑在機(jī)體發(fā)揮作用［13-15］。有研究表明，MEL可以升高SOD、GSH-Px、CAT，降低丙二醛（MDA）水平，從而降低活性氧、減輕氧化應(yīng)激，保護(hù)低溫保存的卵巢組織［16］。本研究中模型組眼眶靜脈血血清中SOD、GSH-Px、CAT活性較正常組降低，提示AMD視網(wǎng)膜處機(jī)體清除自由基能力降低，可能造成氧自由基堆積，損傷細(xì)胞和組織；MEL 治療后眼眶靜脈血血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性升高，提示 MEL 可以增強(qiáng)機(jī)體自由基清除能力，實(shí)現(xiàn)對氧化損傷的保護(hù)。

SIRT1作為腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白脫乙酰酶，可以通過乙?；M蛋白修飾賴氨酸殘基，F(xiàn)OXO1可以與SIRT1 啟動子區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合，激活SIRT1，又可通過SIRT1 介導(dǎo)發(fā)揮抗氧化、抗炎等作用［17］。上調(diào) SIRT1 的 mRNA 和蛋白表達(dá)并抑制FOXO1、FOXO3和FOXO4的mRNA和蛋白表達(dá)可預(yù)防心肌細(xì)胞凋亡［18］。上調(diào)SIRT1可以提高高糖條件下足細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px活性，減少細(xì)胞中活性氧水平及足細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與減輕氧化損傷有關(guān)［19］。MEL通過以受體依賴的方式激活SIRT1信號傳導(dǎo)而減輕氧化應(yīng)激和血管平滑肌細(xì)胞損傷，發(fā)揮對胸主動脈瘤和夾層的治療作用［20］。本研究中，模型組視網(wǎng)膜組織中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平較正常組降低，提示AMD可抑制SIRT1/FOXO1通路，使該通路發(fā)揮抗氧化、抗炎作用降低，導(dǎo)致自由基積累，加重氧化損傷，經(jīng)MEL治療后，視網(wǎng)膜組織中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平升高，提示MEL 可以激活SIRT1/FOXO1 通路，從而提高SOD、GSH-Px、CAT活性，增加氧自由基的清除能力，減輕氧化損傷。

綜上所述，MEL 可能通過激活SIRT1/FOXO1 通路實(shí)現(xiàn)對AMD 視網(wǎng)膜氧化損傷的保護(hù)。本文在動物模型上驗(yàn)證了MEL對AMD的治療作用，可為臨床上AMD的治療提供一定參考依據(jù)，但SIRT1/FOXO1通路與MEL之間的具體調(diào)控位點(diǎn)尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。