長(zhǎng)鏈非編碼RNA與先天腭裂畸形的關(guān)系研究進(jìn)展

唐璟，宋慶高

腭裂是常見(jiàn)的頜面部先天缺陷，可單獨(dú)發(fā)生，也可與唇裂合并或作為遺傳綜合征的一部分出現(xiàn)。腭裂與唇腭裂由于病因及胚胎發(fā)育起源的相似性而密切相關(guān)。腭裂患者因腭部裂隙及腭咽閉合不全，導(dǎo)致嚴(yán)重的語(yǔ)音、飲食障礙及頜骨發(fā)育不良。給患者及家庭帶來(lái)巨大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，腭裂的潛在病因尚未明確，先天缺陷的形成機(jī)制尚不清楚。研究認(rèn)為，腭裂是復(fù)雜的多基因遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果［1］。胚胎腭突間充質(zhì)細(xì)胞(embryo palatal mesenchymal cell，EPMC）的分化增殖和正中嵴上皮細(xì)胞（medial edge epithelial cell，MEEC）的轉(zhuǎn)歸是腭突融合的關(guān)鍵步驟。特定的信號(hào)通路和基因表達(dá)通過(guò)與細(xì)胞間的信息交流控制著腭突融合的每一步。腭部的發(fā)育需要對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精確的時(shí)空調(diào)控，這是由錯(cuò)綜復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)及其相應(yīng)的DNA 基序控制的。任何對(duì)此網(wǎng)絡(luò)的微小干擾都可能導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在腭發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色。對(duì)全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWASs）數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，80%以上的疾病相關(guān)遺傳位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)編碼基因之外［2］，這表明非編碼基因在腭裂的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是非編碼RNA中重要的一類(lèi)，與腭裂的發(fā)生密切相關(guān)。lncRNA 可發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）功能，其與微小 RNA（microRNA，miRNA）結(jié)合形成的 lncRNA-miRNA 表達(dá)模式在唇腭裂與正常的組織細(xì)胞中有著顯著差異，提示它們可能通過(guò)參與調(diào)控某些生物過(guò)程的特定靶基因和信號(hào)表達(dá)，從而在唇腭裂的形成和調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用［3］。本文將在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上對(duì)與腭裂有關(guān)的lncRNA 作用機(jī)制及l(fā)ncRNA-miRNA 相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行綜述，旨在為腭裂的發(fā)病機(jī)制研究提供新的參考和視角。

1 上腭的發(fā)育過(guò)程

腭部組織可分為前腭突與側(cè)腭突，前腭突源于原始口腔前界的胚胎額鼻突，而側(cè)腭突則由原始口腔兩側(cè)的上頜突生長(zhǎng)形成，在腭突發(fā)育初期，未分化的EPMC 可大量增殖。此時(shí)的舌體發(fā)育很快，幾乎充滿(mǎn)原始口腔，使最初向中線方向生長(zhǎng)的兩側(cè)腭突只能向下垂直生長(zhǎng)，位于舌的兩側(cè)。隨后，由于下頜骨的生長(zhǎng)發(fā)育及腭突體積增大等因素，舌體的形態(tài)逐漸扁平，側(cè)腭突上升到舌背上方的水平位置，并向中線生長(zhǎng)，兩側(cè)腭突開(kāi)始接觸，并與前腭突和鼻中隔相融合。在雙側(cè)腭突發(fā)生接觸后，通過(guò)MEEC 的遷移、自噬、凋亡及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT），其緊密粘連形成正中上皮帶（medial epithelial seam，MES），隨后MES逐漸變薄形成上皮條索，而條索斷裂后成為上皮島，最終完全消失，形成完整的口腔頂部［4-5］。由上可知，腭部的發(fā)育有著精確的時(shí)空順序，對(duì)其發(fā)育過(guò)程任何環(huán)節(jié)的干擾都可能引起腭裂的發(fā)生。

2 LncRNA及競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA概述

LncRNA 是長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其能以多種調(diào)節(jié)方式參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞的增殖分化和疾病的發(fā)生發(fā)展［6］。LncRNA 主要通過(guò)以下3 種方式參與基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控［7］。（1）轉(zhuǎn)錄水平。部分lncRNA基因在自身轉(zhuǎn)錄時(shí)，可干擾下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響mRNA 的生成，調(diào)控蛋白編碼基因表達(dá)。（2）轉(zhuǎn)錄后水平。lncRNA 可作為 ceRNA 與miRNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平間接調(diào)節(jié)miRNA參與的生物學(xué)過(guò)程。（3）表觀遺傳學(xué)水平。lncRNA 可影響基因甲基化修飾，調(diào)控下游基因表達(dá)。

曾有學(xué)者提出了ceRNA 假說(shuō)來(lái)解釋lncRNA、miRNA和mRNA之間的作用，認(rèn)為lncRNA擁有類(lèi)似miRNA反應(yīng)元件，可以作為ceRNA與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，降低miRNA 對(duì)靶基因mRNA 的抑制作用，從而調(diào)節(jié)編碼基因的表達(dá)水平，形成跨轉(zhuǎn)錄組的大規(guī)模調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［8］。因此，lncRNA與miRNA的相互作用關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)，其ceRNA-miRNA-mRNA模式反映了不同RNA之間的調(diào)節(jié)對(duì)話新方式，極大拓寬了人類(lèi)基因組遺傳信息的功能，并在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育、疾病發(fā)生轉(zhuǎn)歸等生理、病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［9-10］。

近年來(lái)，對(duì) lncRNA、lncRNA-miRNA 調(diào)節(jié)軸的探索主要集中于腫瘤等疾病領(lǐng)域，相關(guān)研究結(jié)果預(yù)見(jiàn)其可作為生物分子標(biāo)志物對(duì)腫瘤的早期篩查、診療和藥物使用有較大幫助［11-12］。目前，先天性發(fā)育畸形的患病率仍然很高，但有關(guān)lncRNA-miRNA 調(diào)節(jié)軸在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究報(bào)道卻較少。非編碼RNA 對(duì)顱面發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，lncRNA、miRNA 均可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等相關(guān)生物過(guò)程，且它們的調(diào)控可相互依存、相互交織，共同形成復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以參與顱面的發(fā)育［13-14］。顯然，lncRNA-miRNA在先天發(fā)育畸形領(lǐng)域的作用有待更深的挖掘。

3 LncRNA導(dǎo)致腭裂發(fā)生的機(jī)制

目前，越來(lái)越多的證據(jù)顯示，lncRNA 在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，人類(lèi)異常的lncRNA 表 達(dá) 可 導(dǎo) 致 多 種 疾 病 發(fā) 生 發(fā) 展［15-16］。lncRNA 可通過(guò)調(diào)控腭發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵基因影響細(xì)胞的分化增殖、凋亡遷移及相關(guān)生物過(guò)程，從而在腭裂的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

3.1 LncRNA 調(diào)控腭胚間充質(zhì)細(xì)胞的分化增殖 EPMC 的分化增殖是腭突生長(zhǎng)的關(guān)鍵。抑制EPMC的增殖可使腭架的生長(zhǎng)延緩，甚至停滯，無(wú)法接觸融合，從而導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。LncRNA H19 在多種組織細(xì)胞中表達(dá)，與大多數(shù)疾病密切相關(guān)。在全反式維甲酸（atRA）誘導(dǎo)的腭裂小鼠模型中，lncRNA H19 與其靶基因胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF2）表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)，IGF2是胚胎發(fā)育過(guò)程中組織細(xì)胞增殖和分化所必需的生長(zhǎng)因子，lncRNA H19 通過(guò)調(diào)控IGF2抑制EPMC 增殖，進(jìn)而抑制腭突的上抬及水平生長(zhǎng)［17-18］。Gao等［19］在對(duì)2，3，7，8-四氯二苯并-二噁英（TCDD）誘導(dǎo)的腭裂小鼠研究中同樣發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19高表達(dá)可抑制IGF2基因，他們認(rèn)為lncRNA H19 和IGF2的甲基化狀態(tài)可能發(fā)生了改變，其異常表達(dá)可抑制EPMC的增殖，延緩腭架的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致腭裂的發(fā)生。LncRNA Meg3 可通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）/Smad 信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和相關(guān)生物過(guò)程［20］。在 atRA 處理的 EPMC 中，lncRNA Meg3 啟動(dòng)子中特定的CpG 位點(diǎn)去甲基化，使得lncRNA Meg3 表達(dá)上調(diào)，通過(guò)負(fù)調(diào)控Smad2蛋白信號(hào)的表達(dá)而抑制EPMC的分化增殖，進(jìn)而抑制腭突的生長(zhǎng)［21］。

3.2 LncRNA影響EMT EMT是腭突融合的重要過(guò)程，也是腭形成過(guò)程中的關(guān)鍵步驟。TGF-β 信號(hào)通路已被證實(shí)可廣泛參與腭突的融合過(guò)程，其調(diào)控的關(guān)鍵因子Smad和Snail在EMT過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19可在TGF-β3基因缺失后的腭裂形成中通過(guò)Smad 信號(hào)途徑調(diào)控EMT 和細(xì)胞凋亡來(lái)阻礙腭突的融合［22］?？梢?jiàn)，lncRNA H19在腭發(fā)育的各個(gè)階段都發(fā)揮著重要作用。在TCDD誘導(dǎo)的腭裂小鼠模型中，對(duì)子代腭裂組織進(jìn)行高通量測(cè)序并且構(gòu)建lncRNA和mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著差異表達(dá)的7 個(gè)lncRNAs 在骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號(hào)通路中富集；BMP信號(hào)通路與腭裂形成密切相關(guān)，是TGF-β超家族的成員，其同樣作用于下游Smad 蛋白，影響EMT過(guò)程；該研究發(fā)現(xiàn)LncRNA ENSMUST00000193657、MSTRG. 56310.1、MSTRG. 13399.1 上 調(diào) ，LncRNA MSTRG.51656.1、MSTRG.40182.1、MSTRG.38487.1、MSTRG.1991.1 下調(diào)，可能通過(guò)靶向結(jié)合Smad1和Smad5抑制EMT作用，從而誘導(dǎo)腭裂發(fā)生［23］。

3.3 LncRNA參與細(xì)胞的自噬和凋亡 細(xì)胞的自噬和凋亡參與腭部的發(fā)育。AMBRA1基因處于自噬和凋亡之間，控制自噬和凋亡之間的相互轉(zhuǎn)換，決定細(xì)胞的死亡或存活［24］。Shu 等［25-26］發(fā)現(xiàn)一個(gè)與腭裂相關(guān)的lncRNA NONMMUT034790.2-LEF1-AMBRA1反式調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)共表達(dá)下調(diào)，其中淋巴增強(qiáng)因子1（lymphoid enhancement factor 1，LEF1）參與腭裂的形成，可與Smad3顯著富集于EMT 的生物學(xué)過(guò)程。AMBRA1 介導(dǎo)的自噬促進(jìn)EMT 的誘導(dǎo)，而TGF-β/Smad3信號(hào)通路在調(diào)節(jié)自噬誘導(dǎo)的EMT中起著關(guān)鍵作用。AMBRA1調(diào)控NONMMUT034790.2 通過(guò)這一反式調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)EMT相關(guān)的自噬和凋亡，可能是腭裂融合功能障礙的重要機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子LEF1可調(diào)控lncRNAs 和基因表達(dá)，形成NONMMUT034790.2-LEF1-Smad7 共表達(dá)反式調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［27］。其中Smad7可通過(guò)Wnt 信號(hào)中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與LEF1相互作用，并通過(guò)TGF-β 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與EMT 過(guò)程。lncRNA NONMMUT034790.2、LEF1、Smad7可能在“l(fā)ncRNA-TF-靶基因”的反式調(diào)節(jié)機(jī)制下介導(dǎo)MEEC的凋亡，抑制EMT作用，從而導(dǎo)致腭突融合失敗。由上可知，lncRNA NONMMUT034790.2-LEF1-Smad7 共表達(dá)反式調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與腭裂的形成有關(guān)，lncRNA NONMMUT034790.2 可能成為腭裂新的表觀遺傳標(biāo)志。

4 LncRNA作為ceRNA在腭裂中的表達(dá)研究

LncRNA 作為 ceRNA 可與 miRNA 相互作用，形成lncRNA-miRNA 調(diào)節(jié)軸，通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路及與基因的相互作用來(lái)參與腭部發(fā)育，從而影響腭裂的發(fā)生發(fā)展。

4.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究 Prkar1α 是編碼蛋白激酶A（PKA）的一個(gè)調(diào)控亞基，可在胚胎發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞的形成、遷移和分化，影響顱面的發(fā)育，參與cAMP 依賴(lài)性蛋白激酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)途徑［28］。研究報(bào)道，在atRA誘導(dǎo)的腭裂小鼠模型中通過(guò)生物信息學(xué)分析確定了69個(gè)lncRNAs、18個(gè)miRNAs和78個(gè)mRNAs 的異常表達(dá)，其中NONMMUT004850.2、NONMUT024276.2和Prkar1α表達(dá)上調(diào)，而miR-741-3p和miR-465b-5p表達(dá)下調(diào)［29］。通過(guò)構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò) 功能 分 析，Shu 等［29］認(rèn) 為 NONMMUT004850.2/NMMUT024276.2 作為 miR-741-3p/miR-465b-5p 的ceRNA 可通過(guò)調(diào)控 Prkar1α 表達(dá)，負(fù)調(diào)節(jié) PKA 活性，從而阻斷腭突融合，NONMMUT004850.2/NMMUT024276.2-miR-741-3p/miR-465b-5p-Prkar1α可能參與調(diào)節(jié)腭部發(fā)育融合過(guò)程。

在GWASs 中發(fā)現(xiàn)存在較多與顱面發(fā)育相關(guān)的潛在致病單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，且鑒定出的大多數(shù)變異體都位于非編碼RNA 區(qū)域內(nèi)［30］。lncRNA RP11-462G12.2 中的rs2262251被認(rèn)為是非綜合征型唇腭裂的潛在致病SNP。SNPrs2262251可影響EPMC 及唇組織中l(wèi)ncRNA RP11-462G12.2的結(jié)構(gòu)和表達(dá)，通過(guò)熒光素酶報(bào)告發(fā)現(xiàn)帶有rs2262251C 等位基因的 lncRNA RP11-462G12.2 可直接靶向結(jié)合IQSEC2，lncRNA RP11-462G12.2 的過(guò)表達(dá)降低了miR-744-5p 的內(nèi)源表達(dá)，導(dǎo)致IQSEC2上調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，表明包含rs2262251C 等位基因的lncRNA RP11-462G12.2 是一種新的miR-744-5p 海綿，可能調(diào)控IQSEC2在唇腭裂發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)，這種關(guān)系可能產(chǎn)生一個(gè)lncRNA-miRNA基因調(diào)節(jié)軸［31］。

4.2 臨床研究 Li 等［32］研究對(duì)比了唇腭裂患者與正常人外周血提取的ncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者存在明顯的表達(dá)差異。Gao 等［3］在唇腭裂和腭裂患者外周血中鑒定了差異表達(dá)的ncRNAs 和mRNAs，并利用生物信息學(xué)方法探索了ncRNAs的潛在功能和關(guān)聯(lián)，構(gòu)建了以 lncRNA 為誘餌、miRNA 為中心、mRNA 為靶點(diǎn)的lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，唇腭裂組與對(duì)照組相比，共有36 個(gè)lncRNAs、1 341 個(gè) mRNAs 和 60 個(gè) miRNAs 有表達(dá)差異；腭裂組與對(duì)照組相比有 57 個(gè)lncRNAs、1 255 個(gè) mRNAs和162 個(gè)miRNAs 有表達(dá)差異?？赡茉陔窳押痛诫窳训牟±碇衅鹬匾饔玫膎cRNAs 和mRNAs 包括：miR-483-3p、miR-92b-5p、miR-4690-3p、miR-654-3p、miR-16-5p、lncRNA rP11-731F5.2、lncRNA XIST、lncRNA rP11-591c20.9 以及 RARA、SMAD2、BAG5、ZEB2 等［33］。值得注意的是，miR-92b-5p 的靶基因lncRNA XIST在腭裂組的表達(dá)明顯上調(diào)，lncRNA rP11-731F5.2 與 miR-483-3p、BAG5、ZEB2間也存在較高的相關(guān)性，且lncRNA rP11-731F5.2靶基因RARA在網(wǎng)絡(luò)中具有更多的邊緣聯(lián)系。由此可見(jiàn)，全轉(zhuǎn)錄組各基因相互調(diào)控、相互聯(lián)系，形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。上述研究表明，對(duì)于頜面部lncRNA-miRNA 的生物信息學(xué)分析可以推測(cè)大量lncRNA-miRNA 調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與腭裂的發(fā)生密切相關(guān)，但其潛在作用機(jī)制還待進(jìn)一步驗(yàn)證。

5 總結(jié)與展望

近年來(lái)，lncRNA、miRNA 研究已成為基因調(diào)控領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通過(guò)總結(jié)腭裂中l(wèi)ncRNA 的作用機(jī)制及l(fā)ncRNA-miRNA基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，lncRNA 作為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要參與者，因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和功能多樣性提供了多種關(guān)于lncRNA 和miRNA 在腭裂中的調(diào)控機(jī)制，lncRNA 和 miRNA 有可能作為腭裂的早期疾病篩查、診斷和防治的潛在標(biāo)志物。隨著對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入研究，將為腭裂的病因探索提供更為豐富的研究思路和更為有效的研究方法，同時(shí)為進(jìn)一步研究腭裂中ncRNAs 和mRNAs的潛在調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。然而，lncRNA和miRNA的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，其在腭裂發(fā)生中的作用機(jī)制仍處于探索階段，大多數(shù)lncRNA 與miRNA 在腭裂中的調(diào)控機(jī)制尚不明確，已知的lncRNA-miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有限，故需要更先進(jìn)有效的研究技術(shù)及方法對(duì)lncRNA 的結(jié)構(gòu)功能和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)更多有意義的lncRNA-miRNA 調(diào)節(jié)軸，以便更深入揭示lncRNA-miRNA基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腭裂發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為腭裂畸形的病因研究、早期篩查及防治靶點(diǎn)提供新的途徑。