張妮 ,簡(jiǎn)久瑩,王笑笑,余婷 ,陳思羽,郭兵 ,劉麗榮△
順鉑是臨床上有效的抗腫瘤藥物,用于治療膀胱癌、卵巢癌、睪丸癌等多種類型的癌癥[1]。順鉑主要經(jīng)腎臟排泄,單次大劑量用藥會(huì)導(dǎo)致急性腎損傷,因而臨床多采用多次小劑量或長(zhǎng)期用藥,但仍會(huì)引起以腎臟纖維化為主要病理特征的慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD),繼而發(fā)展為終末期腎衰竭[2]。順鉑致CKD是涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多因素的復(fù)雜過程,研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)與順鉑致腎損傷發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[3]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)被認(rèn)為是參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白[4]。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶2(SET and MYND domain containing 2,SMYD2)是含有SET結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶[5-6]。SMYD2 在常染色體顯性多囊腎小鼠及患者的腎上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),SMYD2可甲基化炎癥轉(zhuǎn)錄因子STAT3 使其磷酸化活化,促進(jìn)囊腫的生長(zhǎng)[7-8]。腎細(xì)胞癌中SMYD2 表達(dá)上調(diào),抑制SMYD2 表達(dá)上調(diào)后可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲[6]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)SMYD2 在糖尿病腎病小鼠腎組織中表達(dá)上調(diào)[9],提示SMYD2表達(dá)上調(diào)與腎臟疾病密切相關(guān)。目前,SMYD2在順鉑致CKD 中作用的研究較少。本研究旨在探討SMYD2與順鉑致CKD炎癥反應(yīng)的相關(guān)性,為臨床防治順鉑致CKD提供新思路。
1.1 材料 16 只SPF 級(jí)健康雄性C57BL/6 小鼠,體質(zhì)量18~22 g,6 周齡,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0002。順鉑(P4394)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA,A5228)鼠多克隆抗體、波形蛋白(Vimentin,V5255)鼠單克隆抗體購自美國Sigma 公司;BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蛋白提取試劑盒購自索萊寶公司;β-肌動(dòng)蛋白(β-actin,bs0061R)兔單克隆抗體購自Bioss 公司;E-鈣黏素蛋白(E-cadherin,20874-1-AP)兔單克隆抗體、膠原蛋白3(Collagen-Ⅲ,22734-1-AP)兔單克隆抗體購自Proteintech公司;纖維粘連蛋白(Fibronectin,ab2413)兔多克隆抗體、STAT3(ab68153)兔單克隆抗體、p-STAT3(ab76315)兔單克隆抗體、腫瘤壞死因子-α(TNF-α,ab1793)兔單克隆抗體購自Abcam 公司;白細(xì)胞介素-6(IL-6,D5W4V)兔單克隆抗體、SMYD2(D14H7)兔單克隆抗體購自Cell Signaling Technology 公司;HRP 標(biāo)記山羊抗兔/鼠二抗購自武漢普美克生物技術(shù)有限公司;電泳儀(DYCZ-24DN)購自北京六一公司;Spectra Max190 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購自美國MD 公司;自動(dòng)生化分析儀購自瑞士羅氏診斷公司;光學(xué)顯微鏡(M30D)購自廣州耐博生物科技有限公司;凝膠成像儀chemiDocXRS+System購自Bio-Rad公司。
1.2 方法
1.2.1 動(dòng)物分組與模型構(gòu)建 16只C57BL/6小鼠正常飲食,自由飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和順鉑組,每組8只。順鉑組給予10 mg/kg順鉑(溶于高壓滅菌的生理鹽水溶液)腹腔注射,對(duì)照組給予相同體積順鉑溶媒,1次/周,連續(xù)注射3周,于第4周處死小鼠。小鼠處死前6 h禁食,麻醉后摘除眼球取血;雙側(cè)腎臟均縱切為兩半,1/2 置于4%多聚甲醛中,制作為石蠟切片進(jìn)行HE、Masson染色;另1/2存放于-80 ℃冰箱,用于提取腎組織蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 腎功能檢測(cè) 收集小鼠血清,使用羅氏702全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)。
1.2.3 HE、Masson染色觀察腎臟病理學(xué)變化 將置于4%多聚甲醛的腎組織制作為石蠟切片后進(jìn)行HE和Masson 染色,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。
1.2.4 Western blot 檢測(cè)腎組織中SMYD2、p-STAT3、STAT3、TNF-α、IL-6、Collagen-Ⅲ、Fibronectin、E-cadherin、α-SMA和Vimentin 蛋白水平 取出存放于-80 ℃冰箱的腎組織,加入蛋白裂解液在勻漿器內(nèi)研磨裂解,4 ℃離心20 min,吸出上清液;BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液的蛋白濃度,加入1×上樣緩沖液將樣本稀釋為2 000 mg/L,煮沸8 min后置于冰上降溫備用。樣本經(jīng)SDS-PAGE 分離,電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,分別加入一抗:β-actin兔單克隆抗體(1∶5 000)、SMYD2 兔單克隆抗體(1∶1 500)、E-cadherin 兔單克隆抗體(1∶10 000)、α-SMA 鼠多克隆抗體(1∶1 000)、Vimentin 鼠單克隆抗體(1∶1 000)、Collagen-Ⅲ兔單克隆抗體(1∶1 000)、Fibronectin 兔多克隆抗體(1∶5 000)、p-STAT3 兔單克隆抗體(1∶2 000)、STAT3 兔單克隆抗體(1∶1 500)、TNF-α(1∶500)兔單克隆抗體和IL-6 兔單克隆抗體(1∶800),4 ℃孵育14~18 h,洗膜后用HRP 標(biāo)記山羊抗兔/鼠二抗室溫孵育1.5 h,化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光。以β-actin 為內(nèi)參,Image J 1.6軟件進(jìn)行灰度值分析。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);使用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 2 組小鼠腎功能比較 對(duì)照組和順鉑組Scr 分別為(14.47±1.87)μmol/L和(33.90±2.56)μmol/L,BUN分別為(8.60±0.63)mmol/L和(27.65±4.07)mmol/L,順鉑組Scr 和BUN 水平明顯升高(n=8,t分別為17.327和13.096,P<0.05)。
2.2 小鼠腎組織形態(tài)學(xué)改變 HE 染色結(jié)果:對(duì)照組腎小球形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整,腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,未見炎性細(xì)胞浸潤;順鉑組腎組織中部分腎小球出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生,且有少量基底膜增厚,部分腎小管發(fā)生顆粒變性和空泡樣變,見圖1。Masson 染色結(jié)果:對(duì)照組腎間質(zhì)無纖維增生,順鉑組出現(xiàn)大量纖維增生,見圖2。
Fig.1 HE staining of mouse kidney tissues(×400)圖1 小鼠腎組織HE染色(×400)
Fig.2 Masson staining of mouse kidney tissues(×200)圖2 小鼠腎組織Masson染色(×200)
2.3 小鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA、Vimentin、Collagen-Ⅲ、Fibronectin、SMYD2、STAT3、p-STAT3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組相比,順鉑組E-cadherin 蛋 白 表 達(dá) 下 降 ,α -SMA、Vimentin、Collagen-Ⅲ、Fibronectin、SMYD2、STAT3、p-STAT3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)增加,見表1,圖3。
Tab.1 Comparison of protein expression levels of E-cadherin,α-SMA,Vimentin,Collagen-Ⅲ,Fibronectin,SMYD2,STAT3,p-STAT3,TNF-α and IL-6 in renal between two groups of mice表1 各組小鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA、Vimentin、Collagen-Ⅲ、Fibronectin、SMYD2、STAT3、p-STAT3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平比較(n=8,)
Tab.1 Comparison of protein expression levels of E-cadherin,α-SMA,Vimentin,Collagen-Ⅲ,Fibronectin,SMYD2,STAT3,p-STAT3,TNF-α and IL-6 in renal between two groups of mice表1 各組小鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA、Vimentin、Collagen-Ⅲ、Fibronectin、SMYD2、STAT3、p-STAT3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平比較(n=8,)
*P<0.05
組別對(duì)照組順鉑組t E-cadherin 1.42±0.27 0.70±0.05 4.514*α-SMA 0.27±0.53 0.91±0.94 10.367*Vimentin 0.10±0.09 2.10±0.17 9.962*Collagen-Ⅲ0.88±0.20 2.06±0.08 9.447*Fibronectin 0.13±0.04 0.26±0.02 4.676*組別對(duì)照組順鉑組t SMYD2 1.27±0.12 1.79±0.15 4.721*STAT3 0.10±0.04 0.28±0.02 6.621*p-STAT3 0.37±0.04 0.62±0.03 8.475*TNF-α 2.66±0.62 4.99±0.57 4.824*IL-6 5.16±0.42 6.22±0.29 3.584*
2.4 各 組 小 鼠 α -SMA、Vimentin、E-cadherin、Fibronectin、Collagen-Ⅲ、STAT3、p-STAT3、TNF-α、IL-6 與SMYD2 的蛋白表達(dá)量相關(guān)性分析 SMYD2與E-cadherin 蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.895,P<0.05),與 α-SMA、Vimentin、Fibronectin、Collagen-Ⅲ、STAT3、p-STAT3、TNF-α 和IL-6 蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)(r分別為 0.991、0.998、0.843、0.932、0.893、0.971、0.835和0.917,P<0.05)。
順鉑主要通過腎臟排泄,在腎臟中高濃度分布或長(zhǎng)時(shí)間蓄積會(huì)導(dǎo)致腎組織損傷和腎功能障礙,臨床發(fā)現(xiàn),約有1/3接受順鉑治療的患者于用藥后會(huì)發(fā)生腎毒性反應(yīng)[10]。腎臟纖維化是各種CKD 的共同病理特征,主要病理表現(xiàn)為腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積[11-13]。腎小管上皮細(xì)胞由上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換為間質(zhì)細(xì)胞表型的過程稱為EMT,EMT是誘導(dǎo)CKD發(fā)生的主要因素,在此過程中上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間黏附特性的上皮細(xì)胞表型,獲得具有遷移、侵襲、增生和分泌促纖維化因子特性的間質(zhì)細(xì)胞表型。本研究結(jié)果顯示,順鉑組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 蛋白表達(dá)明顯下降;間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、α-SMA蛋白表達(dá)明顯增加,提示腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。具有間質(zhì)細(xì)胞表型的細(xì)胞可合成大量由Fibronectin 和Collagen-Ⅲ組成的ECM,腎間質(zhì)ECM 過度沉積,導(dǎo)致腎臟纖維化和腎功能受損[14-15]。結(jié)合順鉑組小鼠腎功能及腎組織形態(tài)學(xué)改變,提示順鉑誘導(dǎo)CKD模型構(gòu)建成功。
STAT3 是重要的炎癥轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)腎臟纖維化具有調(diào)控作用[16-17]?;罨腟TAT3信號(hào)通路可促進(jìn)EMT和ECM蛋白合成[18]。疾病狀態(tài)下(如梗阻性腎臟病、糖尿病腎病及肺炎等),細(xì)胞質(zhì)中的STAT3 受到炎性細(xì)胞因子刺激與受體結(jié)合后被磷酸化(p-STAT3)而激活,p-STAT3蛋白以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合,調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,發(fā)揮促進(jìn)疾病病程的重要作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示,在順鉑誘導(dǎo)的CKD小鼠腎組織中炎性因子TNF-α和IL-6表達(dá)顯著上調(diào);p-STAT3 和STAT3 表達(dá)增加,提示STAT3信號(hào)通路的活化可能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與順鉑致CKD的發(fā)生發(fā)展。
研究證實(shí),表觀遺傳調(diào)控在腎臟疾病中發(fā)揮重要作用[8]。SMYD2是含有SET結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,可甲基化組蛋白和非組蛋白(如STAT3)。據(jù)報(bào)道,SMYD2的過表達(dá)參與了不同疾病發(fā)生發(fā)展的過程,有望成為治療疾病的新靶標(biāo)[21]。有研究通過SMYD2 特異性抑制劑干預(yù)和siRNA 基因沉默證實(shí)了SMYD2 是腎囊腫生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)控因子,且SMYD2 誘導(dǎo)囊性腎上皮細(xì)胞增殖的過程可激活STAT3信號(hào)通路;而此通路的激活可誘導(dǎo)SMYD2表達(dá)上調(diào),形成SMYD2/STAT3/SMYD2 正反饋回路[7]。在三陰性乳腺癌細(xì)胞和小鼠中,SMYD2 可甲基化STAT3 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與存活,抑制SMYD2可延緩腫瘤增殖;應(yīng)用STAT3 抑制劑干預(yù)后,SMYD2表達(dá)下調(diào),腫瘤增殖得以延緩,形成SMYD2/STAT3/SMYD2正反饋回路[22]。在結(jié)腸癌患者、結(jié)腸癌細(xì)胞及原發(fā)性肝癌患者中SMYD2 表達(dá)也明顯上調(diào)[21,23]。本研究發(fā)現(xiàn),在順鉑致 CKD 小鼠腎組織中SMYD2 表達(dá)上調(diào),相關(guān)性分析結(jié)果顯示,SMYD2 與α-SMA、Vimentin、Collagen-Ⅲ和Fibronectin 呈正相關(guān),與E-cadherin 呈負(fù)相關(guān),提示SMYD2 可能促進(jìn)順鉑致 CKD 發(fā)生發(fā)展;SMYD2 與 p-STAT3、STAT3、TNF-α 和 IL-6 呈正相關(guān),提示 SMYD2 可能參與順鉑致CKD炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。
綜上所述,SMYD2可能與STAT3信號(hào)通路共同介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與順鉑致CKD 的發(fā)生發(fā)展,但SMYD2 與STAT3 信號(hào)通路間的相互作用關(guān)系仍需進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)予以證明,這也將是本課題組后續(xù)的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。SMYD2 有望成為防治順鉑致CKD的新靶點(diǎn),但具體調(diào)控機(jī)制需在今后的研究工作中進(jìn)行更深入的探討,進(jìn)而為臨床防治順鉑致CKD提供理論依據(jù)。