組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶2與順鉑致慢性腎臟病炎癥反應(yīng)的相關(guān)性研究

張妮 ，簡久瑩，王笑笑，余婷 ，陳思羽，郭兵 ，劉麗榮△

順鉑是臨床上有效的抗腫瘤藥物，用于治療膀胱癌、卵巢癌、睪丸癌等多種類型的癌癥［1］。順鉑主要經(jīng)腎臟排泄，單次大劑量用藥會導(dǎo)致急性腎損傷，因而臨床多采用多次小劑量或長期用藥，但仍會引起以腎臟纖維化為主要病理特征的慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD），繼而發(fā)展為終末期腎衰竭［2］。順鉑致CKD是涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多因素的復(fù)雜過程，研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)與順鉑致腎損傷發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［3］。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）被認(rèn)為是參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白［4］。組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶2（SET and MYND domain containing 2，SMYD2）是含有SET結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶［5-6］。SMYD2 在常染色體顯性多囊腎小鼠及患者的腎上皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，SMYD2可甲基化炎癥轉(zhuǎn)錄因子STAT3 使其磷酸化活化，促進(jìn)囊腫的生長［7-8］。腎細(xì)胞癌中SMYD2 表達(dá)上調(diào)，抑制SMYD2 表達(dá)上調(diào)后可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲［6］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)SMYD2 在糖尿病腎病小鼠腎組織中表達(dá)上調(diào)［9］，提示SMYD2表達(dá)上調(diào)與腎臟疾病密切相關(guān)。目前，SMYD2在順鉑致CKD 中作用的研究較少。本研究旨在探討SMYD2與順鉑致CKD炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，為臨床防治順鉑致CKD提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 16 只SPF 級健康雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，6 周齡，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。順鉑（P4394）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，A5228）鼠多克隆抗體、波形蛋白（Vimentin，V5255）鼠單克隆抗體購自美國Sigma 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白提取試劑盒購自索萊寶公司；β-肌動蛋白（β-actin，bs0061R）兔單克隆抗體購自Bioss 公司；E-鈣黏素蛋白（E-cadherin，20874-1-AP）兔單克隆抗體、膠原蛋白3（Collagen-Ⅲ，22734-1-AP）兔單克隆抗體購自Proteintech公司；纖維粘連蛋白（Fibronectin，ab2413）兔多克隆抗體、STAT3（ab68153）兔單克隆抗體、p-STAT3（ab76315）兔單克隆抗體、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，ab1793）兔單克隆抗體購自Abcam 公司；白細(xì)胞介素-6（IL-6，D5W4V）兔單克隆抗體、SMYD2（D14H7）兔單克隆抗體購自Cell Signaling Technology 公司；HRP 標(biāo)記山羊抗兔/鼠二抗購自武漢普美克生物技術(shù)有限公司；電泳儀（DYCZ-24DN）購自北京六一公司；Spectra Max190 型全波長酶標(biāo)儀購自美國MD 公司；自動生化分析儀購自瑞士羅氏診斷公司；光學(xué)顯微鏡（M30D）購自廣州耐博生物科技有限公司；凝膠成像儀chemiDocXRS+System購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型構(gòu)建 16只C57BL/6小鼠正常飲食，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和順鉑組，每組8只。順鉑組給予10 mg/kg順鉑（溶于高壓滅菌的生理鹽水溶液）腹腔注射，對照組給予相同體積順鉑溶媒，1次/周，連續(xù)注射3周，于第4周處死小鼠。小鼠處死前6 h禁食，麻醉后摘除眼球取血；雙側(cè)腎臟均縱切為兩半，1/2 置于4%多聚甲醛中，制作為石蠟切片進(jìn)行HE、Masson染色；另1/2存放于-80 ℃冰箱，用于提取腎組織蛋白進(jìn)行Western blot實驗。

1.2.2 腎功能檢測 收集小鼠血清，使用羅氏702全自動生化分析儀檢測血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）。

1.2.3 HE、Masson染色觀察腎臟病理學(xué)變化 將置于4%多聚甲醛的腎組織制作為石蠟切片后進(jìn)行HE和Masson 染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 Western blot 檢測腎組織中SMYD2、p-STAT3、STAT3、TNF-α、IL-6、Collagen-Ⅲ、Fibronectin、E-cadherin、α-SMA和Vimentin 蛋白水平 取出存放于-80 ℃冰箱的腎組織，加入蛋白裂解液在勻漿器內(nèi)研磨裂解，4 ℃離心20 min，吸出上清液；BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定上清液的蛋白濃度，加入1×上樣緩沖液將樣本稀釋為2 000 mg/L，煮沸8 min后置于冰上降溫備用。樣本經(jīng)SDS-PAGE 分離，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入一抗：β-actin兔單克隆抗體（1∶5 000）、SMYD2 兔單克隆抗體（1∶1 500）、E-cadherin 兔單克隆抗體（1∶10 000）、α-SMA 鼠多克隆抗體（1∶1 000）、Vimentin 鼠單克隆抗體（1∶1 000）、Collagen-Ⅲ兔單克隆抗體（1∶1 000）、Fibronectin 兔多克隆抗體（1∶5 000）、p-STAT3 兔單克隆抗體（1∶2 000）、STAT3 兔單克隆抗體（1∶1 500）、TNF-α（1∶500）兔單克隆抗體和IL-6 兔單克隆抗體（1∶800），4 ℃孵育14～18 h，洗膜后用HRP 標(biāo)記山羊抗兔/鼠二抗室溫孵育1.5 h，化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光。以β-actin 為內(nèi)參，Image J 1.6軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；使用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組小鼠腎功能比較 對照組和順鉑組Scr 分別為（14.47±1.87）μmol/L和（33.90±2.56）μmol/L，BUN分別為（8.60±0.63）mmol/L和（27.65±4.07）mmol/L，順鉑組Scr 和BUN 水平明顯升高（n=8，t分別為17.327和13.096，P＜0.05）。

2.2 小鼠腎組織形態(tài)學(xué)改變 HE 染色結(jié)果：對照組腎小球形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤；順鉑組腎組織中部分腎小球出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生，且有少量基底膜增厚，部分腎小管發(fā)生顆粒變性和空泡樣變，見圖1。Masson 染色結(jié)果：對照組腎間質(zhì)無纖維增生，順鉑組出現(xiàn)大量纖維增生，見圖2。

Fig.1 HE staining of mouse kidney tissues(×400)圖1 小鼠腎組織HE染色（×400）

Fig.2 Masson staining of mouse kidney tissues(×200)圖2 小鼠腎組織Masson染色（×200）

2.3 小鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA、Vimentin、Collagen-Ⅲ、Fibronectin、SMYD2、STAT3、p-STAT3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平 與對照組相比，順鉑組E-cadherin 蛋 白 表 達(dá) 下 降 ，α -SMA、Vimentin、Collagen-Ⅲ、Fibronectin、SMYD2、STAT3、p-STAT3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)增加，見表1，圖3。

Tab.1 Comparison of protein expression levels of E-cadherin,α-SMA,Vimentin,Collagen-Ⅲ,Fibronectin,SMYD2,STAT3,p-STAT3,TNF-α and IL-6 in renal between two groups of mice表1 各組小鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA、Vimentin、Collagen-Ⅲ、Fibronectin、SMYD2、STAT3、p-STAT3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平比較（n=8，）

Tab.1 Comparison of protein expression levels of E-cadherin,α-SMA,Vimentin,Collagen-Ⅲ,Fibronectin,SMYD2,STAT3,p-STAT3,TNF-α and IL-6 in renal between two groups of mice表1 各組小鼠腎組織中E-cadherin、α-SMA、Vimentin、Collagen-Ⅲ、Fibronectin、SMYD2、STAT3、p-STAT3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)水平比較（n=8，）

＊P＜0.05

組別對照組順鉑組t E-cadherin 1.42±0.27 0.70±0.05 4.514＊α-SMA 0.27±0.53 0.91±0.94 10.367＊Vimentin 0.10±0.09 2.10±0.17 9.962＊Collagen-Ⅲ0.88±0.20 2.06±0.08 9.447＊Fibronectin 0.13±0.04 0.26±0.02 4.676＊組別對照組順鉑組t SMYD2 1.27±0.12 1.79±0.15 4.721＊STAT3 0.10±0.04 0.28±0.02 6.621＊p-STAT3 0.37±0.04 0.62±0.03 8.475＊TNF-α 2.66±0.62 4.99±0.57 4.824＊IL-6 5.16±0.42 6.22±0.29 3.584＊

2.4 各 組 小 鼠 α -SMA、Vimentin、E-cadherin、Fibronectin、Collagen-Ⅲ、STAT3、p-STAT3、TNF-α、IL-6 與SMYD2 的蛋白表達(dá)量相關(guān)性分析 SMYD2與E-cadherin 蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.895，P＜0.05），與 α-SMA、Vimentin、Fibronectin、Collagen-Ⅲ、STAT3、p-STAT3、TNF-α 和IL-6 蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)（r分別為 0.991、0.998、0.843、0.932、0.893、0.971、0.835和0.917，P＜0.05）。

3 討論

順鉑主要通過腎臟排泄，在腎臟中高濃度分布或長時間蓄積會導(dǎo)致腎組織損傷和腎功能障礙，臨床發(fā)現(xiàn)，約有1/3接受順鉑治療的患者于用藥后會發(fā)生腎毒性反應(yīng)［10］。腎臟纖維化是各種CKD 的共同病理特征，主要病理表現(xiàn)為腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積［11-13］。腎小管上皮細(xì)胞由上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換為間質(zhì)細(xì)胞表型的過程稱為EMT，EMT是誘導(dǎo)CKD發(fā)生的主要因素，在此過程中上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間黏附特性的上皮細(xì)胞表型，獲得具有遷移、侵襲、增生和分泌促纖維化因子特性的間質(zhì)細(xì)胞表型。本研究結(jié)果顯示，順鉑組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin 蛋白表達(dá)明顯下降；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin、α-SMA蛋白表達(dá)明顯增加，提示腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。具有間質(zhì)細(xì)胞表型的細(xì)胞可合成大量由Fibronectin 和Collagen-Ⅲ組成的ECM，腎間質(zhì)ECM 過度沉積，導(dǎo)致腎臟纖維化和腎功能受損［14-15］。結(jié)合順鉑組小鼠腎功能及腎組織形態(tài)學(xué)改變，提示順鉑誘導(dǎo)CKD模型構(gòu)建成功。

STAT3 是重要的炎癥轉(zhuǎn)錄因子，對腎臟纖維化具有調(diào)控作用［16-17］。活化的STAT3信號通路可促進(jìn)EMT和ECM蛋白合成［18］。疾病狀態(tài)下（如梗阻性腎臟病、糖尿病腎病及肺炎等），細(xì)胞質(zhì)中的STAT3 受到炎性細(xì)胞因子刺激與受體結(jié)合后被磷酸化（p-STAT3）而激活，p-STAT3蛋白以二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮促進(jìn)疾病病程的重要作用［19-20］。本研究結(jié)果顯示，在順鉑誘導(dǎo)的CKD小鼠腎組織中炎性因子TNF-α和IL-6表達(dá)顯著上調(diào)；p-STAT3 和STAT3 表達(dá)增加，提示STAT3信號通路的活化可能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與順鉑致CKD的發(fā)生發(fā)展。

研究證實，表觀遺傳調(diào)控在腎臟疾病中發(fā)揮重要作用［8］。SMYD2是含有SET結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可甲基化組蛋白和非組蛋白（如STAT3）。據(jù)報道，SMYD2的過表達(dá)參與了不同疾病發(fā)生發(fā)展的過程，有望成為治療疾病的新靶標(biāo)［21］。有研究通過SMYD2 特異性抑制劑干預(yù)和siRNA 基因沉默證實了SMYD2 是腎囊腫生長的關(guān)鍵調(diào)控因子，且SMYD2 誘導(dǎo)囊性腎上皮細(xì)胞增殖的過程可激活STAT3信號通路；而此通路的激活可誘導(dǎo)SMYD2表達(dá)上調(diào)，形成SMYD2/STAT3/SMYD2 正反饋回路［7］。在三陰性乳腺癌細(xì)胞和小鼠中，SMYD2 可甲基化STAT3 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖與存活，抑制SMYD2可延緩腫瘤增殖；應(yīng)用STAT3 抑制劑干預(yù)后，SMYD2表達(dá)下調(diào)，腫瘤增殖得以延緩，形成SMYD2/STAT3/SMYD2正反饋回路［22］。在結(jié)腸癌患者、結(jié)腸癌細(xì)胞及原發(fā)性肝癌患者中SMYD2 表達(dá)也明顯上調(diào)［21，23］。本研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑致 CKD 小鼠腎組織中SMYD2 表達(dá)上調(diào)，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，SMYD2 與α-SMA、Vimentin、Collagen-Ⅲ和Fibronectin 呈正相關(guān)，與E-cadherin 呈負(fù)相關(guān)，提示SMYD2 可能促進(jìn)順鉑致 CKD 發(fā)生發(fā)展；SMYD2 與 p-STAT3、STAT3、TNF-α 和 IL-6 呈正相關(guān)，提示 SMYD2 可能參與順鉑致CKD炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，SMYD2可能與STAT3信號通路共同介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與順鉑致CKD 的發(fā)生發(fā)展，但SMYD2 與STAT3 信號通路間的相互作用關(guān)系仍需進(jìn)行相關(guān)實驗予以證明，這也將是本課題組后續(xù)的重點(diǎn)研究內(nèi)容。SMYD2 有望成為防治順鉑致CKD的新靶點(diǎn)，但具體調(diào)控機(jī)制需在今后的研究工作中進(jìn)行更深入的探討，進(jìn)而為臨床防治順鉑致CKD提供理論依據(jù)。