不同途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對慢性腎病大鼠腎臟纖維化的影響

李嘉琦，楊揚(yáng)，李天祎，楊素萍，夏春娟，王家平△

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）是一類發(fā)病率和病死率較高的慢性疾病［1］。研究顯示，炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的腎間質(zhì)纖維化是CKD 主要的進(jìn)展途徑之一，而炎癥小體激活后釋放的促炎細(xì)胞因子可促進(jìn)纖維化的形成，其中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like protein 3，NLRP3）炎癥小體已被證實(shí)與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展有關(guān)［2］。隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞療法展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。目前，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）被廣泛研究，其調(diào)節(jié)免疫、抗炎等功能在多種疾病中可發(fā)揮修復(fù)作用［3］。但是，BMSCs 能否通過抑制NLRP3 炎癥小體來修復(fù)腎間質(zhì)纖維化尚不明確。本研究旨在探討B(tài)MSCs 對阿霉素所致CKD大鼠腎臟的修復(fù)作用及其減輕纖維化的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 50 只清潔級SD 雄性大鼠購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。其中2 只4 周齡大鼠提供骨髓供體干細(xì)胞；余48 只8 周齡大鼠，體質(zhì)量（300.18±14.27）g，其中36 只用于造模，12只作為假手術(shù)（SHAM）組。阿霉素購自Sigma公司；低糖培養(yǎng)基（L-DMEM）、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；BMSCs 成骨成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購自賽業(yè)（蘇州）生物科技公司；HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒、0.25%胰蛋白酶購自武漢塞維爾生物科技公司；NLRP3、凋亡相關(guān)微粒蛋白［apoptosis-associated speck-like protein containing Caspase recruitment domain（CARD），ASC］、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）抗體購自賽默飛世爾科技有限公司；自動(dòng)生化分析儀（日立7170型，日本）。

1.2 BMSCs 制備 2 只4 周齡健康雄性SD 大鼠脫頸處死后置于75%乙醇中浸泡5 min。剪斷股骨、脛骨骨骺端，參照文獻(xiàn)［4］分離培養(yǎng)BMSCs。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長方式，取第3代細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面抗原CD29、CD44、CD45及CD11b陽性率，合格的BMSCs應(yīng)表達(dá)CD29和CD44，而不表達(dá)CD45和CD11b［5］。細(xì)胞傳代至4～6代，取生長至80%～90%融合的細(xì)胞備用。

1.3 CKD 模型制作及分組 48 只8 周齡大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，其中36 只通過左腎切除+多次尾靜脈注射阿霉素進(jìn)行CKD造模，大鼠全麻后俯臥位固定于超凈臺，逐層切開皮膚、肌肉，暴露左腎后切除；蘇醒后尾靜脈注入阿霉素造模，第一次劑量為3 mg/kg，2 周后同劑量再次注射；每周經(jīng)眼內(nèi)眥靜脈取血檢測腎功能，以血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白升高，取腎切片HE 染色光鏡觀察符合慢性腎病改變?yōu)樵炷３晒Γ?］。所有大鼠均造模成功，將大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為模型（CKD）組、腎動(dòng)脈移植BMSCs（A-M）組及尾靜脈移植BMSCs組（V-M）組，每組12 只。余12 只為SHAM 組，不切除左腎，僅行開腹及剝離腎包膜操作。

1.4 各組干預(yù)方案 0.25%胰蛋白酶-EDTA將生長狀況良好的BMSCs消化后加入L-DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 500 r/min離心5 min，棄上清液后磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細(xì)胞，吹打充分后制成2×106個(gè)/mL單細(xì)胞懸液保存?zhèn)溆?。A-M組大鼠參照文獻(xiàn)［7］在數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）透視下用無菌微導(dǎo)管（PE10）經(jīng)左側(cè)頸動(dòng)脈插管至右腎動(dòng)脈開口處，同時(shí)經(jīng)導(dǎo)管推注少量肝素后再推注BMSCs懸液500 μL，術(shù)后逐層縫合切口并肌內(nèi)注射80萬U青霉素0.1 mL；V-M組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg）后俯臥位固定于操作臺，經(jīng)尾靜脈注射等量BMSCs 溶液；Sham 組大鼠腹腔注射10%水合氯醛后俯臥位固定于操作臺，經(jīng)尾靜脈注射500 μL生理鹽水。

1.5 主要觀測指標(biāo)

1.5.1 大鼠血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白檢測 分別于BMSCs移植后第7、14天的前1 d，將各組大鼠放入代謝籠中，收集24 h 尿液并儲存于-80 ℃冰箱。次日經(jīng)尾靜脈采血0.2 mL 常溫靜置 3 h，3 500 r/min 離心 15 min 分離血清，生化分析儀檢測血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白。

1.5.2 腎臟組織病理損傷及纖維化程度檢測 各組于治療14 d末處死大鼠，迅速取出大鼠腎臟組織于10%福爾馬林緩沖溶液中固定24 h，將石蠟包埋的腎組織切成4 μm薄片，蘇木精和伊紅（HE）染色、Masson三色染色，光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織病理損傷及纖維化程度。參照Mizuguchi 等［8］方法對腎臟組織進(jìn)行評分：0分為極少量或無病變；1分為輕度受損，纖維化范圍0～25%；2分為中度受損，纖維化范圍26%～50%；3分為重度受損，纖維化范圍≥51%。

1.5.3 免疫組化檢測腎組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)情況 每組其余切片用免疫組織化學(xué)法染色。石蠟切片脫蠟至水，將組織切片放入盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH=6.0）的修復(fù)盒中，修復(fù)盒行抗原修復(fù)并自然冷卻后，切片放入3%過氧化氫溶液孵育25 min，洗滌3 次，用3%封閉緩沖液（BSA）均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。將切片稀釋后分別與 NLRP3（1∶150）、ASC（1∶150）、Caspase-1（1∶150）抗體在4 ℃下孵育過夜。PBS漂洗3次，每次5 min，滴加與一抗相應(yīng)種屬的HRP 標(biāo)記二抗（1∶150）覆蓋組織，室溫孵育50 min。滴加3，3′-二苯二甲酰肼（DAB）復(fù)染，梯度乙醇脫水后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 的分離純化與鑒定 倒置顯微鏡下可見SD大鼠BMSCs為均勻貼壁生長的梭形細(xì)胞，呈漩渦狀排列生長，傳代至第3 代經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定表型CD29 陽性率96.9%，CD44 陽性率98.9%，CD45 陽性率1.9%、CD11b陽性率2.2%，成骨、成脂誘導(dǎo)染色可見橘紅色鈣結(jié)節(jié)、紅色脂滴形成，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的主要生物學(xué)特征，見圖1。

2.2 各組大鼠血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白情況比較 CKD組、V-M組及A-M組7 d和14 d的血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白表達(dá)水平依次降低，但均高于SHAM組（P＜0.05），見表1。

2.3 各組大鼠腎臟病理表現(xiàn)及纖維化程度 SHAM組HE染色未見明顯病理改變，腎小球血管袢薄且清晰，腎小管形態(tài)正常，Masson三色染色未見膠原纖維沉積，纖維化評分0分；CKD組腎小球損傷部分可見空泡變性，系膜細(xì)胞和基質(zhì)可見增生，出現(xiàn)局灶節(jié)段性硬化，腎小管萎縮，Masson 三色染色可見腎小球囊、小管間質(zhì)周邊大面積膠原增生，可見大量藍(lán)色著染膠原纖維，纖維化評分 3 分；A-M 組、V-M 組可見腎小球可見不同程度萎縮，腎小管間質(zhì)可見少量輕-中度淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤并伴有結(jié)締組織增生，其中 A-M 組病理學(xué)形態(tài)較 V-M 組輕微，A-M 組、V-M組Masson 三色染色均可見藍(lán)色著染膠原纖維，V-M組纖維化評分2分，A-M組纖維化評分1分，見圖2。

2.4 各組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)水平比較 SHAM組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)均呈陰性；CKD 組、V-M 組、A-M 組大鼠 NLRP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)均呈陽性，但陽性細(xì)胞數(shù)依次降低，見圖3。

3 討論

Fig.1 Morphology of the 3rd generation,staining for osteogenic differentiation and adipogenic differentiation(×100)圖1 第3代BMSCs細(xì)胞形態(tài)、成骨誘導(dǎo)分化染色及成脂誘導(dǎo)分化染色（×100）

Tab.1 Comparison of serum creatinine,urea nitrogen and 24 h urinary protein after BMSCs transplantation between the four groups表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白比較 （n=12，）

Tab.1 Comparison of serum creatinine,urea nitrogen and 24 h urinary protein after BMSCs transplantation between the four groups表1 各組大鼠血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白比較 （n=12，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與SHAM組比較，b與CKD組比較，c與V-M組比較，P＜0.05

組別SHAM組CKD組V-M組A-M組F血肌酐（μmol/L）7 d 34.72±3.54 94.76±3.61a 86.80±2.97ab 68.68±3.77abc 701.718＊＊14 d 33.97±3.54 106.59±7.56a 100.63±5.66ab 90.96±2.82abc 485.438＊＊尿素氮（mmol/L）7 d 2.54±0.19 7.80±0.25a 5.78±0.39ab 3.74±0.49abc 510.003＊＊14 d 2.63±0.55 6.95±0.40a 6.22±0.19ab 5.79±0.18abc 317.993＊＊24 h尿蛋白（mg）7 d 25.30±0.65 54.23±1.65a 40.08±1.77ab 30.76±2.17abc 696.089＊＊14 d 26.53±1.42 50.51±1.75a 39.04±2.49ab 36.29±2.11abc 295.399＊＊

Fig.2 Pathological manifestations of renal tissues in the four groups(×200)圖2 各組大鼠腎組織病理表現(xiàn)（×200）

Fig.3 Immunohistochemical staining results of NLRP3,ASC and Caspase-1 in the four groups(×200)圖3 各組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1免疫組化染色結(jié)果（×200）

CKD 容易進(jìn)展為終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD），后者往往需要透析、腎移植等腎替代療法。維持性透析治療不能完全替代腎臟功能，而腎移植由于供體、費(fèi)用問題也不能廣泛開展。BMSCs因其易于取材、體外擴(kuò)增方便、具有多向分化潛能，成為疾病治療的新選擇。目前，常用的BMSCs移植途徑包括靜脈途徑、動(dòng)脈途徑和局部注射，然而不同途徑對BMSCs 的治療效果的影響不同，對于移植途徑仍然存在爭議。李芳等［9］在用臍帶血干細(xì)胞治療犬腎損傷模型中發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈途徑和靜脈途徑治療效果無明顯差別。龔勇泉等［10］在小鼠心臟移植模型中發(fā)現(xiàn)，BMSCs 動(dòng)脈途徑移植較靜脈及心肌局部注射更能延長移植心臟存活時(shí)間。謝周滔等［11］在小鼠腎缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，靜脈途徑移植BMSCs較動(dòng)脈途徑效果更佳，創(chuàng)傷較小。因此，BMSCs通過何種移植途徑能較好地改善CKD 大鼠腎功能及其減輕或延緩腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，A-M 組、V-M 組與 CKD 組相比腎功能（血肌酐、尿素氮、24 h 尿蛋白）改善，A-M組效果優(yōu)于 V-M 組；HE 染色、Masson 三色染色顯示，BMSCs移植后腎臟炎性浸潤減輕，纖維化程度降低，A-M 組改善程度優(yōu)于V-M 組，表明經(jīng)腎動(dòng)脈途徑移植效果優(yōu)于經(jīng)尾靜脈途徑。筆者分析可能與移植細(xì)胞在體內(nèi)分布數(shù)量不同有關(guān)，通過介入方法經(jīng)動(dòng)脈途徑注射后大量干細(xì)胞可直接進(jìn)入受損腎組織，避免了外周靜脈途徑所必經(jīng)的肺循環(huán)過程，增加了歸巢細(xì)胞數(shù)量。傳統(tǒng)的直接腎動(dòng)脈穿刺途徑注射雖然在實(shí)驗(yàn)中可行，但在實(shí)際操作中存在一些限制，如大鼠體積較小，穿刺可能撕裂腎動(dòng)脈，造成術(shù)中大出血或者腎動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，進(jìn)而導(dǎo)致腎動(dòng)脈狹窄，甚至閉塞。因此，相較于傳統(tǒng)開腹直接注射方法，本研究通過介入途徑經(jīng)左頸總動(dòng)脈腎動(dòng)脈途徑注入BMSCs有著精準(zhǔn)、微創(chuàng)的優(yōu)勢。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，持續(xù)性炎癥是慢性腎損傷重要標(biāo)志，無菌性炎癥是CKD的臨床特征［12］。炎癥小體是Nod樣受體家族蛋白與PYHIN家族蛋白組成的細(xì)胞質(zhì)多蛋白復(fù)合物，在先天免疫中起重要作用，其中NLRP3炎癥小體在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及腎間質(zhì)纖維化中的作用受到廣泛關(guān)注。NLRP3 炎癥小體由NLRP3、ASC 和 pro-caspase-1 構(gòu)成。研究發(fā)現(xiàn)，至少有 2 種信號是NLRP3炎癥小體激活所必需：（1）由Toll樣受體或細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α識別的微生物配體介導(dǎo)，激活核因子途徑，引起NLRP3蛋白水平上調(diào)。（2）由各種病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式刺激介導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)ASC 和pro-Caspase-1 的組裝，誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化［13］。因此，在慢性腎損傷過程中會(huì)有NLRP3、ASC、Caspase-1 的陽性表達(dá)水平的升高。Ke 等［14］發(fā)現(xiàn)，在 CKD 患者的腎臟中，NLRP3和Caspase-1的表達(dá)水平顯著升高，表明活化的NLRP3 炎癥小體可能參與腎間質(zhì)纖維化調(diào)節(jié)。部分研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3 炎癥小體可導(dǎo)致5/6 腎切除模型和晶體性腎病的腎間質(zhì)纖維化［15-16］。研究顯示，小鼠敲除NLRP3基因或使用NLRP3炎癥小體活性抑制劑MCC950 抑制炎癥小體表達(dá)后，小鼠腎間質(zhì)纖維化程度均減輕［17-18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NLRP3、ASC、Caspase-1 在單側(cè)腎切除并多次阿霉素注射的腎間質(zhì)纖維化模型中表達(dá)呈陽性，表明其參與了腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程；免疫組化結(jié)果顯示，BMSCs 移植后NLRP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)降低，故筆者推測BMSCs 可能通過抑制NLRP3 炎癥小體活性來減輕大鼠的腎間質(zhì)纖維化。

綜上所述，BMSCs移植療法可改善大鼠腎功能，減輕組織纖維化程度，且經(jīng)腎動(dòng)脈途徑移植優(yōu)于經(jīng)尾靜脈途徑。單側(cè)腎切除并多次阿霉素注射的腎間質(zhì)纖維化模型中NLRP3炎癥小體成分增加。BMSCs可能是通過降低NLRP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)來改善CKD大鼠腎功能。