miR-422a靶向激肽釋放酶-4抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲

宋鵬霞，李群鋒，曹焰暉，姚水洪

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性生命健康，2020年全球有60萬新增病例和34萬死亡病例［1］。目前，宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制對臨床診治具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一種能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小分子RNA。miRNA 通常與靶基因mRNA 的3′非編碼區(qū)（UTR）通過堿基互補(bǔ)的方式配對，進(jìn)而抑制下游 mRNA 的降解或翻譯［2］。miRNA的表達(dá)變化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-422a屬于miRNA中的一員，在多種癌細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，發(fā)揮抑癌作用［3-5］。然而，miR-422a在宮頸癌中的作用尚未明確。本研究旨在探討miR-422a及其下游靶基因?qū)m頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，為宮頸癌的早期診斷、精確靶向治療和預(yù)后改善提供新思路和新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎細(xì)胞HEK293T，宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa以及人正常宮頸細(xì)胞株H8 均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。miR-NC、miR-422a、mut miR-422a均購自上海吉瑪基因股份有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；pcDNA購自蘇州金唯智公司；miR-422a靶向激肽釋放酶-4（KLK4）野生型 3′-UTR 由蘇州金唯智合成并連接到pcDNA載體；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自美國Abcam公司；鼠源KLK4一抗、鼠源Tubulin一抗、羊抗鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；SYBR Green Ⅰ購自北京索萊寶科技有限公司；基質(zhì)膠購自加拿大BD Biosciences 公司；總mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa 公司；PVDF 膜購自美國密理博公司；多功能酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek 公司；電泳儀購自美國Bio-Rad 公司；實時熒光定量PCR（qPCR）儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa、SiHa、H8細(xì)胞分別接種于含10%胎牛血清的完全DMEM 培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化酶進(jìn)行傳代，細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，提取細(xì)胞RNA。

1.2.2 qPCR 檢測細(xì)胞 miR-422a 表達(dá)水平 將 HeLa、SiHa、H8細(xì)胞分別接種于6孔板中（2×105個/mL），當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，檢測miR-422a 表達(dá)水平。引物序列見表1。RNA 提取試劑盒提取總RNA。cDNA 逆轉(zhuǎn)錄采用TaqMan Reverse Transcription Reagents、200 ng 總 RNA 及 Oligo dT，嚴(yán)格按照試劑說明書操作。按照SYBR Green 試劑盒說明檢測miR-422a 表達(dá)水平。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性 15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40 個循環(huán)，以 U6 作為內(nèi)參。2-ΔΔCt法計算miR-422a的相對表達(dá)水平。選取相對表達(dá)量最低的細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實驗。

Tab.1 Sequence of primers表1 引物序列

1.2.3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將1.2.2 選出的細(xì)胞系分為blank組、miR-NC 組、miR-422a 組、mut miR-422a 組、miR-422a+pcDNA組、miR-422a+pcDNA-KLK4組，轉(zhuǎn)染前1 d，將各組細(xì)胞接種于6 孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，使用Lipofectamine 2000 對各組細(xì)胞分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h 后更換為完全培養(yǎng)液，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 CCK-8 檢測各組細(xì)胞增殖情況 取轉(zhuǎn)染48 h 后的blank 組、miR-NC 組、miR-422a 組、miR-422a+pcDNA 組、miR-422a+pcDNA-KLK4 組細(xì)胞，胰酶消化并分別以1×104個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)0、2、4、6 d，每個時間點設(shè)置6個平行孔，于每日相同的時間點，每孔分別加入10 μL/孔CCK-8試劑，在37 ℃、5%CO2孵育箱中避光培養(yǎng)1 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的光密度（OD）值，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 遷移實驗：收集轉(zhuǎn)染后的 blank 組、miR-NC 組、miR-422a 組、miR-422a+pcDNA組、miR-422a+pcDNA-KLK4 組細(xì)胞，胰酶消化并離心，純DMEM重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，取200 μL的重懸液（約含有5×104個細(xì)胞）加入小室的上層，小室下層加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)有4個復(fù)孔，放入孵育箱中培養(yǎng)，分別于6 h 和12 h 取出小室，加入700 μL 多聚甲醛固定20 min，再用結(jié)晶紫染色15 min，清水沖洗多余的結(jié)晶紫，并用棉簽輕輕擦掉小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，固定后自然晾干，置于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)讀取5 個視野，在倒置顯微鏡下計數(shù)染色細(xì)胞。侵襲實驗：將保存于-20 ℃并已分裝好的Matrigel 基質(zhì)膠放置于冰盒中，4 ℃過夜解凍，用純DMEM 稀釋，稀釋比例為1∶7；稀釋后的100 μL基質(zhì)膠加入上室，放入37 ℃、5%CO2孵育箱中3～4 h，使其凝固，其余步驟同遷移實驗。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-422a 與KLK4 的結(jié)合 使用TargetScan 軟件（http://www.targetscan.org/vert_72/）預(yù)測miR-422a 下游靶基因。為確定KLK4 mRNA 的3′UTR 是否為 miR-422a 的直接靶蛋白，將 KLK4 mRNA 的野生型全長3′UTR 序列，克隆至pcDNA 質(zhì)粒構(gòu)建野生型質(zhì)粒，并命名pcDNA-KLK4。提前1 d將HEK293T細(xì)胞（1×105個細(xì)胞/孔）接種于24 孔板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到 80%，將 3 組質(zhì)粒 miR-NC+pcDNA-KLK4、miR-422a+pcDNA-KLK4、mut miR-422a+pcDNA-KLK4 分 別 共 轉(zhuǎn) 染HEK293T 細(xì)胞，培養(yǎng) 24 h 后，按照 Dual-Luciferase Reporter Assay System 說明書操作，檢測熒光素酶相對活性。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7 Western blot 檢測細(xì)胞KLK4 蛋白表達(dá) 收集1.2.3 各組細(xì)胞，胰酶消化并提取各組細(xì)胞總蛋白，取10 μL 蛋白行10%的SDS-PAGE，PVDF 轉(zhuǎn)膜，浸入5%的脫脂奶粉中封閉1 h，加入KLK4 抗體（1∶1 000 稀釋），4 ℃過夜孵育，漂洗后，加入HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗（1∶10 000稀釋），37 ℃孵育1 h，漂洗3 次后，加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，顯影，Image J 分析灰度值，計算各組KLK4蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。不同時點多組間比較采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-422a 在細(xì)胞中的表達(dá)情況 與正常宮頸細(xì)胞 H8（1.001±0.041）相比，宮頸癌細(xì)胞 SiHa 和HeLa 中miR-422a 的相對表達(dá)量分別為0.363±0.062、0.213±0.030，均顯著下降（n=6，F(xiàn)=103.440，P＜0.01），后續(xù)實驗選擇miR-422a表達(dá)量最低的宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行。

2.2 miR-422a對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響 與miR-NC 組和 blank 組比較，miR-422a 組 4、6 d 細(xì)胞OD450明顯下降（P＜0.01），而 blank 組和miR-NC 組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

Tab.2 Comparison of OD450 at different time points between blank group,miR-NC group and miR-422a group表2 Blank組、miR-NC組、miR-422a組細(xì)胞不同時間點OD450比較 （n=6，）

Tab.2 Comparison of OD450 at different time points between blank group,miR-NC group and miR-422a group表2 Blank組、miR-NC組、miR-422a組細(xì)胞不同時間點OD450比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；F組間=44.261，F(xiàn)時間=1 438.930，F(xiàn)交互=12.331，均 P＜0.01；a與blank組比較，b與miR-NC組比較，P＜0.05

組別blank組miR-NC組miR-422a組F OD450 0 d 0.37±0.02 0.41±0.03 0.38±0.03 1.149 2 d 0.66±0.06 0.73±0.03 0.64±0.03 1.881 4 d 0.97±0.05 0.98±0.02 0.86±0.06ab 4.861＊＊6 d 1.71±0.15 1.73±0.16 1.50±0.13ab 21.268＊＊

2.3 KLK4 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-422a 過表達(dá)對宮頸癌HeLa 細(xì)胞增殖的影響 與miR-422a+pcDNA 組相比，miR-422a+pcDNA-KLK4組4、6 d細(xì)胞OD450明顯升高（P＜0.01），見表3。

Tab.3 Comparison of OD450 at different time points between blank group,miR-422a+pcDNA group and miR-422a+pcDNA-KLK4 group表3 Blank組、miR-422a+pcDNA組、miR-422a+pcDNAKLK4組細(xì)胞不同時間點OD450比較（n=6，）

Tab.3 Comparison of OD450 at different time points between blank group,miR-422a+pcDNA group and miR-422a+pcDNA-KLK4 group表3 Blank組、miR-422a+pcDNA組、miR-422a+pcDNAKLK4組細(xì)胞不同時間點OD450比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；F組間=146.056，F(xiàn)時間=2 011.021，F(xiàn)交互=25.748，均P＜0.01；a與blank組比較，b與miR-422a+pcDNA組比較，P＜0.05

組別blank組miR-422a+pcDNA組miR-422a+pcDNAKLK4組F OD450 0 d 0.46±0.04 0.38±0.05 0.44±0.04 2 d 0.66±0.06 0.59±0.08 0.63±0.06 4 d 0.94±0.09 0.80±0.08a 0.97±0.08b 6 d 1.71±0.16 1.27±0.14a 1.62±0.15b 1.1981.25010.014＊＊49.105＊＊

2.4 miR-422a對宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與miR-NC和blank組相比，6、12 h miR-422a組遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。而miR-NC 組和blank 對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4，圖1、2。

Tab.4 Comparison of cell migration and invasion between blank group,miR-NC group and miR-422a group表4 Blank組、miR-NC組、miR-422a組細(xì)胞遷移、侵襲情況比較 （n=6，個/視野，）

Tab.4 Comparison of cell migration and invasion between blank group,miR-NC group and miR-422a group表4 Blank組、miR-NC組、miR-422a組細(xì)胞遷移、侵襲情況比較 （n=6，個/視野，）

＊＊P＜0.01，a與blank組比較，b與miR-NC組比較，P＜0.05

組別blank組miR-NC組miR-422a組F細(xì)胞遷移6 h 87.20±4.47 84.70±6.38 40.80±10.84ab 51.211＊＊12 h 164.80±3.61 174.60±6.35 90.90±8.72ab 84.462＊＊細(xì)胞侵襲6 h 55.50±4.40 54.50±3.60 25.80±6.51ab 37.253＊＊12 h 106.70±7.40 108.60±9.15 47.90±9.08ab 116.025＊＊

2.5 KLK4 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-422a 過表達(dá)對宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與miR-422a+pcDNA組相比，miR-422a+pcDNA-KLK4 組 6、12 h 遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增多，見表5，圖3、4。

2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C結(jié)果 TargetScan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-422a與KLK4 3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點，見圖 5。miR-NC+pcDNA-KLK4 組、miR-422a+pcDNA-KLK4 組 、mut miR-422a+pcDNAKLK4 組共轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶相對活性分別為0.786±0.083、0.342±0.059 和 1.032±0.092，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.848，n=6，P＜0.01）。其中miR-422a+pcDNA-KLK4 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶的相對活性較miR-NC+pcDNA-KLK4降低（P＜0.05），而mut miR-422a+pcDNA-KLK4 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶的相對活性較miR-422a+pcDNA-KLK4 上升（P＜0.05）。

Fig.1 Effects of miR-422a overexpression on the invasion of HeLa cells(×200)圖1 miR-422a對HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）

Fig.2 Effects of miR-422a overexpression on the migration of HeLa cells(×200)圖2 miR-422a對HeLa細(xì)胞遷移能力的影響（×200）

Tab.5 Comparison of cell migration and invasion between blank group,miR-422a+pcDNA group and miR-422a+pcDNA-KLK4 group表5 Blank組、miR-422a+pcDNA組、miR-422a+pcDNA-KLK4組細(xì)胞遷移和侵襲情況比較 （n=6，個/視野，）

Tab.5 Comparison of cell migration and invasion between blank group,miR-422a+pcDNA group and miR-422a+pcDNA-KLK4 group表5 Blank組、miR-422a+pcDNA組、miR-422a+pcDNA-KLK4組細(xì)胞遷移和侵襲情況比較 （n=6，個/視野，）

＊＊P＜0.01，a與blank組比較，b與miR-422a+pcDNA組比較，P＜0.05

組別blank組miR-422a+pcDNA組miR-422a+pcDNA-KLK4組F細(xì)胞遷移 細(xì)胞侵襲6 h 85.30±5.37 45.20±4.35a 74.30±8.94b 61.321＊＊12 h 130.40±10.18 85.7±7.35a 124.60±9.35b 90.526＊＊6 h 58.50±6.62 20.80±6.80a 44.50±8.41b 42.289＊＊12 h 98.70±6.66 43.90±6.35a 89.60±8.72b 83.244＊＊

2.7 miR-422a 對宮頸癌 HeLa 細(xì)胞中 KLK4 蛋白表達(dá)水平的影響 與miR-NC 組（1.001±0.081）相比，miR-422a組中KLK4蛋白的表達(dá)水平降低為0.183±0.064；與 miR-422a 組 相 比 ，mut miR-422a 組 中KLK4 蛋白的表達(dá)水平升高為1.104±0.306（n=6，F(xiàn)=12.848，P＜0.01），見圖 6。與 miR-422a+pcDNA 組相比，miR-422a+pcDNA-KLK4組中KLK4蛋白的表達(dá)水平升高（0.463±0.237vs.0.881±0.189），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=6，F(xiàn)=20.848，P＜0.01），見圖7。

Fig.3 Overexpression of KLK4 reversed the inhibitory effect of miR-422a on HeLa cell invasion(×200)圖3 過表達(dá)KLK4蛋白逆轉(zhuǎn)miR-422a對HeLa細(xì)胞侵襲的抑制作用（×200）

Fig.4 Overexpression of KLK4 reversed the inhibitory effect of miR-422a on HeLa cell migration(×200)圖4 過表達(dá)KLK4蛋白逆轉(zhuǎn)miR-422a對HeLa細(xì)胞遷移的抑制作用（×200）

Fig.5 TargetScan software predicted the specific binding sites between miR-422a and KLK4圖5 TargetScan軟件預(yù)測miR-422a與KLK4的特異性結(jié)合位點

Fig.6 Effects of miR-422a on KLK4 protein expression圖6 miR-422a對KLK4蛋白表達(dá)的影響

Fig.7 Expressions of KLK4 proteins in the 3 groups of cells圖7 3組細(xì)胞中KLK4蛋白表達(dá)情況

3 討論

miR-422a在多種腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)行為。miR-422a 在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，過表達(dá)miR-422a 能夠抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖和腫瘤的形成［6］。Zheng等［7］研究發(fā)現(xiàn)miR-422a在結(jié)直腸腺癌中低表達(dá)，過表達(dá)miR-422a 可抑制直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，與正常宮頸H8細(xì)胞相比，宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞系中miR-422a同樣呈現(xiàn)低表達(dá)，其中在宮頸癌HeLa 細(xì)胞中更明顯，因此選擇在宮頸癌HeLa 細(xì)胞驗證其功能。本研究中，與blank和miR-NC組相比，miR-422a組細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯下降，提示miR-422a在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了腫瘤抑制作用。

miRNA 主要通過與靶向蛋白基因的3′ UTR 互補(bǔ)匹配，從而抑制其靶基因表達(dá)。因此，探討miR-422a 的靶向基因是了解miR-422a 在癌癥中抑癌作用機(jī)制的關(guān)鍵。Zhu 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，miR-422a 通過靶向CDC40 mRNA 3′ UTR，抑制胃癌細(xì)胞的增殖。在 Liu 等［9］研究中，miR-422a 通過靶向轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β2 的表達(dá)進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲。在膠質(zhì)瘤中，miR-422a通過靶向胰島素樣生長因子1（IGF1）和IGF1 受體（IGF1R）抑制細(xì)胞增殖、侵襲與遷移［10］。在肺癌細(xì)胞中miR-422a 通過靶向結(jié)合KLK4 mRNA的3′UTR進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖［11］。本研究通過miRNA 靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)KLK4 基因與miR-422a 存在結(jié)合位點；采用雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-422a 能夠降低KLK4 3′UTR野生型的熒光素酶活性。Western blot檢測結(jié)果表明過表達(dá)miR-422a 能夠靶向負(fù)調(diào)控KLK4蛋白的表達(dá)水平，這與Zhu等［11］的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了KLK4 是miR-422a 的靶基因。KLK4 屬于人組織激肽釋放酶基因家族中絲氨酸蛋白酶，有關(guān)KLK 在組織和細(xì)胞中的分布以及生理（和病理生理）功能方面的研究已取得了進(jìn)展［12］。研究發(fā)現(xiàn)KLK4參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，如在卵巢癌［13-14］、前列腺癌［15］、乳腺癌［16］、子宮內(nèi)膜癌［17］、口腔鱗狀細(xì)胞癌［18］中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并且均與預(yù)后不良有關(guān)。本研究中，CCK-8、Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果表明，過表達(dá)KLK4 蛋白能夠逆轉(zhuǎn)miR-422a過表達(dá)對宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用。以上結(jié)果證實miR-422a 可以通過抑制KLK4的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，miR-422a在宮頸癌細(xì)胞系中低表達(dá)，過表達(dá)miR-422a 可通過下調(diào)KLK4 蛋白水平，抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究初步證實了miR-422a可能是治療宮頸癌潛在的分子作用靶點，為宮頸癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的研究提供了理論基礎(chǔ)。