EM患者子宮內(nèi)膜組織的ESCs中miR-539表達(dá)水平及其靶向MMP-9對ESCs侵襲和遷移的影響

肖田 ，廉紅梅

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EM）常見于育齡婦女，是一種良性、慢性的婦科疾病，具有雌激素依賴性，以存在侵襲性異位內(nèi)膜為特征，且與許多臨床癥狀和體征密切相關(guān)，如盆腔疼痛、痛經(jīng)、不孕和性交困難等［1-2］。關(guān)于EM 的發(fā)病機(jī)制有3 種學(xué)說，其中最有說服力的是月經(jīng)逆行學(xué)說，即子宮內(nèi)膜碎片植入子宮外部，如腹膜和腹部器官，尤其是卵巢［3］。細(xì)胞遷移和侵襲在子宮內(nèi)膜異位囊腫的形成中起重要作用，但其分子機(jī)制尚不清楚。因此，需要進(jìn)一步探討EM 的發(fā)病機(jī)制，以找到更有針對性的治療方法。EM表現(xiàn)為良性形態(tài)，然而子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（endometrial stromal cells，ESCs）具有侵襲潛能，EM 常表現(xiàn)出一些惡性特征，如侵襲性增加、血管生成異常以及組織粘連廣泛［4］。已有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）可能在EM 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。MMPs 可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲，并廣泛參與血管重塑，這些是EM 形成的必要過程［5］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一種小的非編碼RNA，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、免疫反應(yīng)和炎癥的基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用［6］。MiRNA的失控和異常表達(dá)與人類多種疾病有關(guān)［7］。MiR-539具有抑制乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的作用［8］，且經(jīng)生物信息學(xué)檢測后發(fā)現(xiàn)，miR-539 與 MMP-9 的 3′- 非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）具有結(jié)合位點(diǎn)，兩者具有明顯的靶向關(guān)系。本研究通過檢測miR-539 在EM 患者子宮異位組織以及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，探討miR-539靶向MMP-9對ESCs侵襲和遷移的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入湖北省婦幼保健院2016年10月—2020年 1 月收治的 EM 患者 60 例，年齡 24～46 歲，平均（30.56±3.81）歲。依據(jù)修訂后的美國生育學(xué)會(huì)子宮內(nèi)膜異位癥（rAFS）分期評定為Ⅰ～Ⅱ期24 例，Ⅲ～Ⅳ期36 例?；颊呤中g(shù)前至少3個(gè)月未接受激素治療，且無其他盆腔病變。收集以上患者術(shù)中子宮內(nèi)膜異位組織，設(shè)為EM組。另取47例年齡匹配的子宮肌瘤等良性婦科疾病患者的正常子宮內(nèi)膜組織設(shè)為對照組。以上組織樣品均在無菌條件下采集，并送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步處理。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（文號：160805-1），取得所有研究對象知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 Lipofectamine 3000 試劑盒（L3000001）購自 Thermo Fisher Technology 公司。RNA 提取試劑盒（貨號：DP419）購自北京天根生化科技有限公司。PrimeScript RT 試劑盒（貨號：RR036）及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（貨號：RR820）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒（貨號：D0010）購自北京索萊寶生物科技有限公司。miR-539 mimics、miR-539 inhibitors及其陰性對照由廣州銳博生物科技有限公司合成 。 miR-539 mimics 序 列 ：上 游 5′-GGAGAAAUUAUCCUUGGUGUGU-3′；下 游 5′-ACACCAAGGAUAAUUUCUCCAUU-3′，雙鏈。對照序列：上游5′-GCCCUACAACUCCCACUCUGUAC-3′ ；下 游 5′-AUUGCCCAAAUAACCGCUACCGU-3′。 miR-539 inhibitor 序 列 ：5′-ACACACCAAGGAUAAUUUCUCCC-3′；對照序列：5′-UCGGGCCUGGAUAGCCCGAUCU-3′，采用 2-O 甲氧基修飾。MMP-9 一抗、內(nèi)參一抗及二抗均購自美國Cell Signaling Technology 公司。光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司；熒光定量PCR（qPCR）儀、蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均購自美國Bio-Rad 公司；GIS-500 型凝膠成像儀購自杭州Miulab公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞分離培養(yǎng) 清洗子宮內(nèi)膜組織，切成小碎片，在37 ℃下于含有Ⅳ型膠原酶（1 g/L）的DMEM/F12 培養(yǎng)基中孵育35 min。然后，使用400 目尼龍細(xì)胞過濾器過濾分離分散的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，離心后收集濾液中的基質(zhì)細(xì)胞，并將其重懸于含有10%FBS 的DMEM/F-12 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h。根據(jù)人波形蛋白陽性和人角蛋白陰性的細(xì)胞染色，結(jié)果顯色，ESCs的純度高于95%［9］。

1.3.2 qPCR檢測miR-539和MMP-9 mRNA的表達(dá)水平 使用RNA 提取試劑盒提取2 組ESCs 中的RNA，并利用分光光度計(jì)測定RNA 濃度。然后使用PrimeScript RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。miR-539的反轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACAC-3′，U6 的反轉(zhuǎn)錄通用引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。然后使用qPCR 儀進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，45 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。以 U6 和 β-actin 為內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt對組織中miR-539 和MMP-9 mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。根據(jù)基因庫數(shù)據(jù)庫中基因序列的公開數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 采用TargetScan 軟件分析，預(yù)測miR-539和MMP-9 3′-UTR 存在結(jié)合位點(diǎn)。將含有miR-539 結(jié)合位點(diǎn)的野生型（WT）和突變型（MUT）MMP-9 3′-UTR基因序列插入熒光素酶報(bào)告基因的載體pGL3上，構(gòu)建相應(yīng)的質(zhì)粒載體，然后將WT-MMP-9、MUT-MMP-9 分別與 miR-539 mimics、miR-539 NC 共轉(zhuǎn)染 ESCs。48 h 后收集細(xì)胞，使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光強(qiáng)度。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將EM 組的ESCs 混合培養(yǎng)至生長對數(shù)期，接種于6孔板上。利用Lipofectamine 3000試劑轉(zhuǎn)染ESCs，并將其分為 miR-539 mimics 組、mimics NC 組、miR-539 inhibitors 組和 inhibitors NC 組。并在 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)檢測。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次，取其平均值。

1.3.5 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖 按照1.3.4 中方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞至96孔板中（每孔3 000個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)，24、48、72 h后，每孔中加入10 μL CCK-8 溶液。然后在37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀檢測450 nm處光密度（OD）值。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將1.3.4 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中，然后用200 μL吸管尖端劃破細(xì)胞單層。用添加1%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以減少細(xì)胞增殖的影響。在劃后0 h和24 h用顯微鏡觀察并拍攝具有代表性的圖像。使用Image-Pro Plus分析軟件對遷移距離進(jìn)行定量，計(jì)算劃痕愈合率=（0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.3.7 Transwell 檢測細(xì)胞侵襲 將1.3.4 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液（2×104個(gè)細(xì)胞）100 μL等量放入Transwell板（含Matrigel基質(zhì)膠）上室。下室裝滿700 μL 含10%FBS 的DMEM/F-12 培養(yǎng)基。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，取出上室，下室細(xì)胞用3.8%甲醛固定20 min 后，0.1%結(jié)晶紫染色。然后使用顯微鏡觀察，并用Image-Pro Plus軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)。

1.3.8 Western blot法檢測MMP-9蛋白表達(dá)水平 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，然后使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并檢測蛋白含量。使用SDS-PAGE分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在室溫下使用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后將膜上的蛋白質(zhì)與MMP-9 一抗以1∶1 000的稀釋度在4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌3次。在室溫下與二抗孵育1 h，TBST洗膜。曝光顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白相對表達(dá)量，以β-actin為內(nèi)參蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-539 和MMP-9 mRNA 表達(dá)水平變化 與對照組相比，EM 組miR-539 mRNA 水平顯著降低，MMP-9 mRNA水平顯著升高（P＜0.01），見表2。

2.2 miR-539與MMP-9靶向關(guān)系的預(yù)測與驗(yàn)證 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，MMP-9 3′-UTR 序列上存在miR-539 連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)，見圖1。與miR-539NC+WT-MMP-9 組 相 比 ，miR-539 mimics+WTMMP-9 組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），miR-539 mimics+MUT-MMP-9 組和miR-539 NC+MUTMMP-9 組熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05），見圖2。

Tab.2 Comparison of miR-539 and MMP-9 mRNA expression levels between the two groups of ESCs表2 2組ESCs中miR-539和MMP-9 mRNA表達(dá)水平的比較 （）

Tab.2 Comparison of miR-539 and MMP-9 mRNA expression levels between the two groups of ESCs表2 2組ESCs中miR-539和MMP-9 mRNA表達(dá)水平的比較 （）

＊＊P＜0.01

組別n miR-539MMP-9 mRNA對照組EM組t 60 47 1.00±0.08 0.43±0.04 44.639＊＊1.00±0.05 1.85±0.07 73.223＊＊

Fig.1 The binding site of miR-539 and MMP-9 3′-UTR predicted by bioinformatics圖1 生物信息學(xué)預(yù)測miR-539與MMP-9 3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)

Fig.2 Comparison of the relative activity of luciferase between the four groups of ESCs(n=6)圖2 4組ESCs細(xì)胞熒光素酶相對活性的比較（n=6）

2.3 miR-539 過表達(dá)對 EM 患者 ESCs 細(xì)胞增殖的影響 72 h 時(shí)，與 mimics NC 組相比，miR-539 mimics 組ESCs 細(xì)胞增殖能力顯著降低（P＜0.05）；48、72 h 時(shí) ，與 inhibitors NC 組 相 比 ，miR-539 inhibitors 組ESCs 細(xì)胞增殖能力顯著升高（P＜0.05），見圖3。

2.4 miR-539 過表達(dá)對 EM 患者 ESCs 細(xì)胞遷移的影響 與 mimics NC 組相比，miR-539 mimics 組ESCs 細(xì)胞的劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05）；與inhibitors NC 組相比，miR-539 inhibitors 組 ESCs 細(xì)胞的劃痕愈合率顯著升高（P＜0.05）。見圖4、5。

Fig.3 Comparison of the proliferation ability of ESCs cells at different time points between the four groups(n=6)圖3 4組ESCs細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖能力的比較（n=6）

Fig.4 Comparison of cell migration ability between the four groups of ESCs圖4 4組ESCs細(xì)胞遷移能力的比較

2.5 miR-539 過表達(dá)對 EM 組 ESCs 細(xì)胞侵襲的影響 與 mimics NC 組相比，miR-539 mimics 組 ESCs的侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與inhibitors NC 組相比，miR-539 inhibitors 組 ESCs 的侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05）。見圖6、7。

Fig.5 Comparison of Scratch healing rate between the four groups of ESCs(n=6)圖5 4組ESCs細(xì)胞劃痕愈合率的比較（n=6）

Fig.7 Comparison of the number of invasive cells between the 4 groups of ESCs(n=6)圖7 4組ESCs細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量的比較（n=6）

2.6 miR-539 過表達(dá)對 EM 組 ESCs 細(xì)胞中 MMP-9蛋白表達(dá)的影響 與mimics NC 組相比，miR-539 mimics 組ESCs 細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與 inhibitors NC 組 相 比 ，miR-539 inhibitors 組ESCs 細(xì)胞的MMP-9 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖8、9。

Fig.8 Expression of MMP-9 protein in four groups of ESCs圖8 4組ESCs細(xì)胞中MMP-9蛋白表達(dá)情況

Fig.9 Comparison of the relative expression levels of MMP-9 protein between the 4 groups of ESCs(n=6)圖9 4組ESCs細(xì)胞中MMP-9蛋白相對表達(dá)水平的比較（n=6）

3 討論

3.1 miR-539 的表達(dá)水平與EM 的發(fā)生發(fā)展有關(guān) EM是一種良性婦科疾病，但其病變具有癌性特征，如細(xì)胞侵襲、遷移和增殖等。人類子宮內(nèi)膜是由不同細(xì)胞組成的復(fù)雜組織，包括腔上皮和腺上皮、間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。ESCs 在子宮內(nèi)膜中的細(xì)胞數(shù)量最多，表明它們在維持子宮內(nèi)膜的正常功能方面發(fā)揮著重要作用［10］。miRNA 是一組長度小于 24 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近年來，miRNAs作為特定基因表達(dá)的抑制因子被認(rèn)為參與了子宮內(nèi)膜的調(diào)控。各種miRNAs 在EM 中的異常表達(dá)已有報(bào)道［11-12］。同時(shí) miR-539 在卵巢癌［13］、乳腺癌［14］等腫瘤中均異常表達(dá)。miR-539過表達(dá)可顯著抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移。本研究顯示，EM患者ESCs中miR-539水平明顯下調(diào)，表明miR-539的表達(dá)水平與EM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

3.2 miR-539可抑制ESCs的增殖、侵襲和遷移 為確定miR-539 在ESCs 中的作用，本研究將miR-539 mimics 和 miR-539 inhibitors 轉(zhuǎn)染至 ESCs。CCK-8結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-539 mimics 的細(xì)胞增殖率明顯降低，而轉(zhuǎn)染miR-539 inhibitors 的細(xì)胞增殖率則升高。ESCs 具有侵襲和遷移能力，這可能與EM 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［15］。本研究顯示，miR-539 過表達(dá)可抑制ESCs的細(xì)胞侵襲和遷移能力，而抑制miR-539表達(dá)則可增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移能力，表明miR-539 在子宮內(nèi)膜異位病變的發(fā)生發(fā)展中起著潛在的抑癌基因作用，miR-539可能通過抑制細(xì)胞增殖、侵襲和遷移而參與EM的發(fā)生發(fā)展。

3.3 miR-539 靶向調(diào)節(jié)MMP-9 來影響EM MMPs是一個(gè)內(nèi)肽酶家族，可參與細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，這也是細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)鍵步驟。MMP-9是重要的細(xì)胞外金屬蛋白酶，在EM 患者體內(nèi)表達(dá)明顯升高，可促進(jìn)EM 細(xì)胞遷移和侵襲［16］。本研究顯示，ESCs 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-539 mimics 后，MMP-9 蛋白水平降低，而miR-539 inhibitors 轉(zhuǎn)染后，MMP-9水平明顯升高，表明miR-539 過表達(dá)可能通過下調(diào)MMP-9 的表達(dá)來抑制ESCs 的遷移和侵襲。因此，推測miR-539 可能是一種EM 抑制基因。另外，熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了MMP-9 是miR-539 的直接靶標(biāo)。miR-539過表達(dá)可抑制MMP-9水平，而抑制miR-539 則結(jié)果相反，表明miR-539 靶向調(diào)節(jié)MMP-9 的水平，提示其有可能成為EM 的分子標(biāo)志物。

本研究表明，miR-539 在 EM 患者 ESCs 中表達(dá)下調(diào)，miR-539 過表達(dá)可下調(diào)MMP-9 水平，抑制ESCs 的遷移和侵襲，提示miR-539 可能成為治療EM 的潛在靶點(diǎn)。然而，miR-539 在EM 中的具體作用和機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。