BMP-9在膽道閉鎖肝纖維化中的作用機(jī)制研究

葛亮 ，茍慶云，趙金鳳 ，張聰，陳靈芝 ，胡曉麗 ，詹江華

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是嬰兒期嚴(yán)重的肝膽系統(tǒng)疾病，以肝內(nèi)、外膽管進(jìn)行性炎癥和纖維性梗阻為特征，繼而導(dǎo)致膽汁淤積、肝纖維化和肝硬化。國(guó)內(nèi)外研究表明進(jìn)行性肝纖維化是影響肝門-空腸吻合術(shù)（Kasai 手術(shù)）預(yù)后的關(guān)鍵因素［1-3］。如何有效阻斷肝纖維化進(jìn)展是目前亟需解決的問(wèn)題。研究表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）/SMAD 信號(hào)通路在BA 肝纖維化中發(fā)揮了重要作用［4］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白 9（bone morphogenetic protein 9，BMP-9）屬 于TGF-β超家族成員，參與調(diào)節(jié)多種生物功能，包括鐵離子平衡、軟骨形成、血管生成、神經(jīng)元分化及脂質(zhì)代謝等。此外，研究表明BMP-9具有促進(jìn)肝纖維化的作用［5］。但 BMP-9 在 BA 肝組織中的表達(dá)情況尚不明確。本研究檢測(cè)了BMP-9 及其下游通路蛋白/基因在BA肝組織中的表達(dá)情況，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討其促進(jìn)纖維化進(jìn)程的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 采用簡(jiǎn)單隨機(jī)法抽取天津市兒童醫(yī)院2018 年1 月—2019 年 1 月收治的 14 例 BA 患兒 Kasai 手術(shù)時(shí)肝組織標(biāo)本為 BA 組，其中男 6 例，女 8 例，手術(shù)日齡 40～82 d，平均（67±11）d。BA 診斷標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)探查及術(shù)中膽道造影確診為Ⅲ型膽道閉鎖。簡(jiǎn)單隨機(jī)法抽取同期5 例膽總管囊腫（congenital biliary dilatation，CBD）患兒手術(shù)時(shí)肝組織標(biāo)本為CBD組，其中男2例，女3例，手術(shù)日齡287～752 d，平均（479±181）d。CBD 診斷標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前根據(jù)腹部超聲及磁共振檢查確診。肝組織標(biāo)本均取自術(shù)中肝右葉前緣組織，10%福爾馬林溶液固定，用于HE、免疫組織化學(xué)染色；部分新鮮肝組織獲取后放置無(wú)菌EP 管中，-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測(cè)。LX-2 人肝星狀細(xì)胞（341818）購(gòu)自BNCC 公司。DMEM 高糖培養(yǎng)液購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；SYBR Green 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；NP-40 蛋白裂解液、PMSF 蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司；RNA 提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（B532435）購(gòu)自生工生物工程有限公司；人重組BMP9（rBMP-9，3209-BP）購(gòu)自R&D systems；人重組TGF-β1（r-TGF-β1）、兔抗人單克隆BMP-9 抗體（bs-6909R）、鼠抗人單克隆磷酸化SMAD1/5（p-SMAD1/5）抗體（bs-3418R）、DNA結(jié)合抑制因子1（inhibitor of DNA binding 1，ID1）抗體（bs-3529R）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）重組兔單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 聚合物均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SMAD1/5抗體購(gòu)自 Cell Signaling Technologies；β-actin 抗體（A01010）購(gòu)自Abbkine。普通光學(xué)顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)購(gòu)自Thermo 公司；LightCycler 96 qPCR 儀購(gòu)自Roche公司；Tanon5200 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海滬析實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化程度評(píng)估 BA 組及CBD 組患兒HE 染色的病理切片由我院專業(yè)病理科醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行肝纖維化分級(jí)，參照METAVIR分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［6］。0級(jí)：無(wú)纖維化；1級(jí)：匯管區(qū)纖維性擴(kuò)大，無(wú)間隔；2級(jí)：匯管區(qū)纖維性擴(kuò)大，少量間隔；3級(jí)：大量間隔伴結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)肝硬化；4級(jí)：肝硬化。本研究將1級(jí)和2級(jí)定義為輕度肝纖維化；將3級(jí)和4級(jí)定義為重度肝纖維化。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝組織中BMP-9、p-SMAD1/5的表達(dá)情況 病理切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)15 min，冷卻至室溫，PBS 緩沖液沖洗5 min×3 次，于3%H2O237 ℃中孵育10 min，再用PBS沖洗5 min×3次，滴加一抗（BMP-9、p-SMAD1/5），于冰箱中4 ℃過(guò)夜，次日取出置于室溫，PBS 洗 5 min×3 次，加二抗于 37 ℃下孵育 30 min，PBS 洗5 min×3 次，經(jīng)DAB 顯色5～10 min，鏡下觀察染色情況，充分水洗，蘇木素液染核，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，于低倍鏡（×100）下觀察染色（棕色）區(qū)域，高倍鏡（×200）下辨別陽(yáng)性細(xì)胞種類及表達(dá)情況。定性分析：根據(jù)染色強(qiáng)度分為無(wú)棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽(yáng)性）、棕黃色（陽(yáng)性）、棕褐色（強(qiáng)陽(yáng)性）。半定量分析：每張切片陽(yáng)性部位處取5個(gè)不同視野100倍顯微鏡下圖片，經(jīng)IPP（Image pro-plus）5.0 分析圖片，計(jì)算BMP-9 及p-SMAD1/5 蛋白的平均光密度值（AOD），AOD=肝組織陽(yáng)性細(xì)胞光密度總和/陽(yáng)性面積。

1.2.3 qPCR檢測(cè)患兒肝組織中BMP-9 及ID1 mRNA的表達(dá)情況 經(jīng)Trizol 法提取人肝組織總RNA，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)總RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，取500 ng RNA進(jìn)行10 μL體系逆轉(zhuǎn)錄。將獲得cDNA 稀釋10 倍，用PCR 反應(yīng)體系在Light Cycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上得出Ct值。實(shí)驗(yàn)條件為：預(yù)變性95 ℃ 180 s；95 ℃ 30 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)；熔解95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算每組樣品中mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Sequence of primers for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.4 LX-2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將人肝星狀細(xì)胞LX-2 置于37 ℃恒溫，5%CO2條件下用DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，加入10%胎牛血清、1%雙抗（100 U/mL 青霉素/鏈霉素），0.3%胰酶消化傳代。分組干預(yù)方法：（1）空白對(duì)照組（正常培養(yǎng)的LX-2 細(xì)胞）、BMP-9 組（加入100 μg/L rBMP-9）、TGF-β1 組（加入50 μg/L rTGF-β1）、BMP-9+TGF-β1 組（同時(shí)加入100 μg/L rBMP-9 及50 μg/L rTGF-β1）。（2）根據(jù)加入rBMP-9 含量不同分為0、10、50及100 μg/L組。

1.2.5 蛋白印跡法檢測(cè)LX-2 細(xì)胞中SMAD1/5、p-SMAD1/5、ID1、α-SMA 蛋白表達(dá)情況 細(xì)胞加入適量RIPA 裂解液重懸，裂解液中含有1×Cock Tai（l蛋白酶抑制劑混合物），反復(fù)吹打幾次混合均勻，在冰上靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清于新的離心管中獲得總蛋白。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量提取總蛋白，細(xì)胞經(jīng)1×loading buffer提取總蛋白。將獲得的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（250 mA恒流90 min），封閉液孵育70 min，4 ℃一抗 α-SMA（1∶1 000）、ID1（1∶1 000）、SMAD1/5（1∶1 000）、p-SMAD1/5（1∶1 000）、β-actin（1∶10 000）孵育過(guò)夜，洗膜后37 ℃孵育二抗（1∶5 000）50 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。通過(guò)數(shù)字圖像處理系統(tǒng)獲得Western blot圖像。以β-actin為對(duì)照內(nèi)參，目的蛋白/內(nèi)參蛋白的灰度值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 qPCR 檢測(cè) LX-2 細(xì)胞中 α-SMA和 ID1 mRNA 的表達(dá)情況 經(jīng)RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)總RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，取500 ng RNA進(jìn)行10 μL體系逆轉(zhuǎn)錄。將獲得 cDNA 稀釋 10 倍，用 PCR 反應(yīng)體系在 Light Cycler 96 qPCR儀上得出Ct 值。反應(yīng)條件同1.2.3。實(shí)驗(yàn)所用引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件及Graphpad prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey 檢驗(yàn)；細(xì)胞水平各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝纖維化程度評(píng)估結(jié)果 5例CBD患兒肝組織中鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)存在，匯管區(qū)無(wú)增寬，膽管及纖維組織無(wú)增生，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝纖維化均為0級(jí)。14例BA患兒肝組織中可見(jiàn)匯管區(qū)增寬，膽管增生，纖維組織增生、橋接纖維化現(xiàn)象普遍，部分患兒可見(jiàn)假小葉形成，伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中輕度肝纖維化8例，重度肝纖維化6例，見(jiàn)圖1。

2.2 肝組織中BMP-9、p-SMAD1/5蛋白的表達(dá)情況

2.2.1 免疫組化定性分析 BMP-9、p-SMAD1/5 在CBD 患兒肝組織中肝細(xì)胞、匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞呈弱陽(yáng)性表達(dá)；在輕度肝纖維化BA患兒肝組織中肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)；在重度肝纖維化BA患兒中膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖2。

Fig.1 HE staining of liver tissue in CBD and BA groups(×40)圖1 CBD、BA組肝組織HE染色情況（×40）

Fig.2 The expression of BMP-9 and p-SMAD1/5 in liver tissues(IHC,×200)圖2 BMP-9、p-SMAD1/5在肝臟組織中的表達(dá)情況（免疫組化，×200）

2.2.2 免疫組化半定量分析 BA 組患兒肝組織中BMP-9 及 p-SMAD1/5 表 達(dá)水平 均 高于 CBD 組（BMP-9：0.154±0.028vs.0.120±0.016，t=2.555；p-SMAD1/5：0.151±0.017vs.0.129±0.018，t=2.317；均P＜0.05）。重度肝纖維化患兒BMP-9 的表達(dá)高于輕度肝纖維化患兒（0.172±0.026vs.0.141±0.023，t=2.335，P＜0.05）；而p-SMAD1/5 在輕度與重度肝纖維化患兒中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.154±0.019vs.0.148±0.017，t=0.573，P＞0.05）。

2.3 肝組織中BMP-9 及ID1 mRNA 表達(dá)水平 BA組 BMP-9 mRNA 表達(dá)水平高于 CBD 組（7.011±3.867vs. 1.000±0.370，t=3.282，P＜0.01）；重度肝纖維化患兒BMP-9 mRNA 表達(dá)高于輕度肝纖維化患兒（2.569±0.522vs. 1.000±0.480，t=7.379，P＜0.01）。BA 組 ID1 mRNA 表達(dá)高于 CBD 組（2.456±0.973vs.1.000±0.365，t=3.088，P＜0.01）；重度肝纖維化患兒ID1 mRNA 表達(dá)高于輕度肝纖維化患兒（1.759±0.442vs.1.000±0.298，t=3.547，P＜0.01）。

2.4 LX-2細(xì)胞α-SMA表達(dá)情況 BMP-9組、TGF-β1 組和 BMP-9+TGF-β1 組 LX-2 細(xì)胞中 α-SMA 蛋白表達(dá)均較空白對(duì)照組升高（n=3，F(xiàn)=544.100，P＜0.05），見(jiàn)圖 3。BMP-9 組、TGF-β1 組和 BMP-9+TGF-β1 組 LX-2 細(xì)胞中 α-SMA mRNA 表達(dá)水平分別為 2.037±0.124、3.108±0.275 和 3.506±0.484 均較空白對(duì)照組（1.000±0.140）升高（n=3，F(xiàn)=29.450，P＜0.01）。

Fig.3 The expression of α-SMA after treatment with rBMP-9(and/or rTGF-β1)圖3 rBMP-9和（或）rTGF-β1處理后細(xì)胞α-SMA表達(dá)情況

2.5 不同濃度rBMP-9干預(yù)后LX-2細(xì)胞SMAD/ID1信號(hào)通路蛋白和ID1、α-SMA mRNA 表達(dá)情況 將LX-2 細(xì)胞加入不同劑量rBMP-9 后，其下游信號(hào)蛋白 p-SMAD1/5、SMAD1/5、ID1 及 α-SMA 表達(dá)增多，ID1及α-SMA mRNA 表達(dá)水平增加（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表2。

Fig.4 The expression of proteins in SMAD/ID1 signaling pathway after treatment with different doses of rBMP-9圖4 不同劑量rBMP-9處理后SMAD/ID1信號(hào)通路蛋白表達(dá)情況

Tab.2 Comparison of ID1 and α-SMA mRNA expression levels after treatment with different doses of rBMP-9 between five groups表2 不同劑量rBMP-9處理后各組ID1及α-SMA mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

BA肝纖維化進(jìn)展迅速且不可逆，部分肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（EMT）以及肝星狀細(xì)胞（HSC）被激活后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展。研究認(rèn)為快速進(jìn)展的肝纖維化與促纖維化通路密切相關(guān)，其中TGF-β1/SMAD 信號(hào)通路在BA 肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用［4］。BMP-9是從骨基質(zhì)中提取的一組誘導(dǎo)異位軟骨及骨形成的細(xì)胞因子，屬于TGF-β 超家族成員，和TGF-β 信號(hào)通路中的配受體結(jié)合形式存在相似性。BMP-9 具有廣泛的生物學(xué)作用，包括影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，參與組織的再生和修復(fù)等［7-8］。BMP-9 主要表達(dá)于肝臟，在健康人體中呈低表達(dá)狀態(tài)［9］。

3.1 BMP-9 參與BA 肝纖維化 本研究結(jié)果顯示，相較于CBD 組，BA 組患兒肝組織中BMP-9 及p-SMAD1/5 蛋白，BMP-9 及 ID1 mRNA 表達(dá)均顯著增加，而且在 BA 組中 BMP-9 蛋白、BMP-9 及 ID1 mRNA表達(dá)水平伴隨著肝纖維化程度加重呈增高趨勢(shì)。盡管p-SMAD1/5在BA 亞組間的表達(dá)無(wú)明顯差異，但是在重度肝纖維化肝組織的匯管區(qū)p-SMAD1/5具有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。由此可見(jiàn)，BA 患兒肝組織中BMP-9/SMAD/ID1 信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平增加，且與肝纖維化輕重程度有關(guān)。BMP-9主要通過(guò)SMAD途徑調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［10］。BMP-9 與Ⅰ型受體（ALK1、ALK2）和Ⅱ型受體（BMPR2、ActRⅡ）結(jié)合后，導(dǎo)致SMAD 1/5/8磷酸化，磷酸化的SMAD 1/5/8與SMAD 4 形成一個(gè)多聚肽復(fù)合物，并向細(xì)胞核遷移，與靶基因中的SMAD 反應(yīng)元件結(jié)合并誘導(dǎo)基因表達(dá)。BMP-9在肝臟可表達(dá)于肝星狀細(xì)胞，隨著肝纖維化逐漸加重，BMP-9及其靶基因ID1表達(dá)增多，抑制BMP-9能夠延緩肝纖維化進(jìn)展［5］。作為BMP-9的靶基因，ID1 在HSC 向成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及HSC的EMT中起重要作用［11］。HSC中ID1的缺失會(huì)影響α-SMA 的合成，表明ID1 在纖維化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［12］。在肝纖維化過(guò)程中，BMP-9激活的ALK1 通過(guò)SMAD1 途徑激活靶基因ID1，從而誘導(dǎo)HSC 分化為成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白［13］。結(jié)合本研究結(jié)果及相關(guān)研究，BMP-9參與BA肝纖維化的進(jìn)程，其可能具有促進(jìn)BA肝纖維化的作用。

3.2 BMP-9通過(guò)SMAD1/5-ID1通路促進(jìn)LX-2纖維化 本研究以rTGF-β1 處理LX-2 細(xì)胞后，α-SMA蛋白及mRNA表達(dá)含量較空白對(duì)照組明顯升高。以rBMP-9 處理 LX-2 細(xì)胞后，α-SMA 蛋白及 mRNA 表達(dá)含量也較空白對(duì)照組明顯升高。TGF-β1 是目前已知最強(qiáng)的促纖維化細(xì)胞因子之一［14］。TGF-β1/SMAD 通路在 BA 肝纖維化中起到了重要作用［15］。整合素蛋白ανβ6等因素激活TGF-β1配體，后者與受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)SMAD2/3 磷酸化，磷酸化的SMAD2/3 與SMAD4 形成絡(luò)合物，并向細(xì)胞核移動(dòng)，啟動(dòng)包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，增加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)，同時(shí)生成基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（TIMP-1）及纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI-1），抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解［16-17］。本研究中TGF-β1 與BMP-9 表現(xiàn)出相似的功效，具有激活肝星狀細(xì)胞、促進(jìn)纖維組織增生的作用，以不同劑量的rBMP-9干預(yù)LX-2 細(xì)胞后，其下游通路p-SMAD1/5、ID1、α-SMA蛋白，及ID1、α-SMA mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)均較0 μg/L 組升高。BMP-9 可通過(guò)激活經(jīng)典的SMAD/ID1信號(hào)通路觸發(fā)并激活肝星狀細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)肝纖維化的進(jìn)展。Li等［18］通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的基因敲低技術(shù)證實(shí)攜帶BMP9-shRNA 的腺病毒可以減輕小鼠的肝纖維化。本研究結(jié)果表明BMP-9 可通過(guò)磷酸化SMAD1/5 誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞核內(nèi)ID1 表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)α-SMA表達(dá)增高，促進(jìn)纖維化進(jìn)程。

綜上所述，在BA 患兒肝組織中BMP-9、p-SMAD1/5、ID1 表達(dá)水平較 CBD 患兒增加，且與肝纖維化程度有關(guān)。BA 患兒肝組織及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示BMP-9 可以通過(guò)SMAD/ID1 信號(hào)通路促進(jìn)BA 肝纖維化進(jìn)程。持續(xù)性肝纖維化是影響B(tài)A 患兒預(yù)后的關(guān)鍵因素，抑制BMP-9可能作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，在一定程度上提高抗肝纖維化藥物的治療效果，從而延長(zhǎng)BA患兒的自體肝生存時(shí)間。