雙黃連凍干粉通過(guò)抑制MEK-ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)急性淋巴細(xì)胞白血病Nalm6細(xì)胞凋亡

楊友 ，鐘芳芳，黃喆，覃祥 ，馬文哲 ，劉文君 △

急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL）由造血干祖細(xì)胞無(wú)限增殖所致，是兒童最常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前治療方式主要為化療。在過(guò)去的20 年中，兒童ALL 的治療取得了顯著進(jìn)展，5年生存率約80%［1］；但化療藥物不良反應(yīng)大，復(fù)發(fā)和耐藥仍是目前需要克服的難題。雙黃連（SHL）由金銀花、黃芩和連翹3味中藥配伍組成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒之功效。既往SHL 在抗細(xì)菌和病毒方面報(bào)道眾多。研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)肺炎克雷伯菌［2］、支原體［3］等細(xì)菌有抑制作用；同時(shí)SHL 含有多種抗病毒成分［4］，對(duì)人腺病毒Ⅲ［5］、甲型H1N1 流感病毒［6］、甲型H5N1 流感病毒［7］和新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）［8］等多種病毒均有明顯抑制效果。在抗腫瘤方面，SHL 可抑制結(jié)腸癌［9］和肺腺癌［10］的增殖。目前尚未見(jiàn)SHL抗白血病作用的報(bào)道。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)通路。絲裂原活化蛋白激酶激酶-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MEK-ERK）是其中的一條信號(hào)通路，可以調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化等［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活可以促進(jìn)白血病細(xì)胞 THP-1、KG-1、HL-60、Jurkat 等增殖，抑制 K562細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［12］。本文通過(guò)探討SHL對(duì)急性B淋巴細(xì)胞白血病Nalm6細(xì)胞MEK/ERK信號(hào)通路的影響，旨在為SHL治療ALL提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人急性B 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（Nalm6）、人急性T 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（Jurkat、Molt4）以及急性髓系白血病細(xì)胞（KG1a）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所。

1.2 藥物與試劑 注射用雙黃連（凍干）購(gòu)自哈藥集團(tuán)中藥二廠有限公司（批號(hào)：Z10960058；規(guī)格：600 mg/支）；泛凋亡抑制劑芐氧羰基-VAL-ALA-ASP-氟甲基酮（Z-VAD-FMK）［13］購(gòu)自美國(guó)MedChemExpresss 公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購(gòu)自北京百靈克公司；Annexin V-APC 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson 公司；hoechest33342 購(gòu)自德國(guó)賽諾菲公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；鼠源 β-actin 一 抗 ，兔 源 cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、cleaved PARP、tBid、ERK、p-ERK、MEK、p-MEK、c-Myc一抗及相應(yīng)二抗購(gòu)自Cell Signaling 公司。

1.3 儀器 倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；AIR-TECH醫(yī)用凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)ACEA NovoCyte 公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Awareness 公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)SHEL-LAB公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞株培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 CCK-8測(cè)定共分為7組，其中使用不同濃度藥物梯度6 組，空白對(duì)照1 組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4 種細(xì)胞，1 000×g離心5 min，棄上清液，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至4×108個(gè)/L；按50 μL/孔接種于96孔板中，每組處理設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)6 h后空白對(duì)照組每孔加入50 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液，其他組分別加入50 μL SHL，使SHL 終濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L。培養(yǎng)24 h后，加入10 μL的CCK-8試劑，孵育4 h后酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處光密度（OD）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取3 孔平均值。按公式算出細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=［（對(duì)照組平均 OD 值-實(shí)驗(yàn)組平均 OD 值）/空白組平均 OD 值］×100%，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布及凋亡 將細(xì)胞以每孔2×106個(gè)接種于6 孔板中，分別加入不同濃度的SHL 使其終濃度為0、0.1、0.2、0.4 g/L，溫育24 h 后，收取細(xì)胞并用PBS洗滌2 次。500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分比。不同濃度的SHL處理后，收取細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入70%的預(yù)冷乙醇充分混勻，放入-20 ℃固定 6 h 后用 PBS 洗滌 2 次，加入 400 μL 的 PI 染液（50 g/L），100 μL 的RNase A（100 g/L），4 ℃避光孵育30 min后用 PBS 洗滌 1 次，加入 500 μL 的 PBS 混懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期百分比。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.4.4 Hoechst 33342 染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài) Nalm6 細(xì)胞經(jīng)0、0.1、0.2、0.4 g/L的SHL處理24 h，收取細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗滌后加入Hoechst 33342 熒光染料（50 g/L），室溫避光孵育5 min，涂片，于熒光顯微鏡下觀察、照相，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) Nalm6細(xì)胞經(jīng)0、0.1、0.2、0.4 g/L的SHL處理24 h，收取細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白。二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜、洗膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入1∶2 000 稀釋的tBid、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、cleaved PARP、MEK、ERK、p-MEK、p-ERK、c-Myc、β-actin 單克隆抗體于4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后加入IRDye TM800CW 染料標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1∶1 000 稀釋?zhuān)覝胤跤? h，TBST 洗滌3 次，每次10 min，用雙紅外激光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光顯色及分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4.6 Z-VAD-FMK預(yù)處理后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Nalm6細(xì)胞凋亡水平變化 Nalm6細(xì)胞經(jīng)Z-VAD-FMK（20 μmol/L）預(yù)處理4 h 后，加入SHL（0.2 g/L）處理24 h，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，檢測(cè)方法同1.4.3。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SHL 對(duì)急性白血病細(xì)胞增殖能力的影響 CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，SHL 能抑制 Nalm6、Jurkat、Molt4 以 及 KG1a 的 增 殖（圖 1）。 SHL 對(duì)Nalm6、Jurkat、Molt4、KG1a 的IC50（g/L）分別為0.11±0.01、0.29±0.01、0.25±0.01、0.32±0.04。其中 SHL 對(duì)Nalm6 的IC50最低，抑制增殖效果更強(qiáng)，因此選取Nalm6 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外，結(jié)合細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的濃度設(shè)置以及Nalm6的IC50，選取SHL質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4 g/L。

2.2 不同濃度SHL 對(duì)Nalm6 細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞周期分析顯示，0.1、0.2、0.4 g/L SHL 對(duì)Nalm6的細(xì)胞周期分布無(wú)明顯影響（P＞0.05），見(jiàn)圖2、表1。

2.3 不同濃度SHL 對(duì)Nalm6 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞凋亡分析顯示，空白對(duì)照組及SHL 0.1、0.2、0.4 g/L 組總凋亡率（%）分別為 2.13±0.12、30.07±3.87、64.35±0.47、90.27±0.43，與空白對(duì)照組相比，SHL 各劑量組細(xì)胞總凋亡率均明顯升高，且隨著SHL濃度升高，細(xì)胞總凋亡率明顯升高（F=544.600，P＜0.01），見(jiàn)圖3。

Fig.1 Cell proliferation inhibition rates of different concentrations of SHL in acute leukemia cells圖1 不同濃度SHL對(duì)急性白血病細(xì)胞的增殖抑制率

Fig.2 Cell cycles of Nalm6 cells induced by different concentrations of SHL圖2 不同濃度SHL對(duì)Nalm6細(xì)胞周期的影響

Tab.1 Cell cycles of Nalm6 cells induced by different concentrations of SHL表1 不同濃度SHL對(duì)Nalm6細(xì)胞周期的影響（n=3，%，）

Tab.1 Cell cycles of Nalm6 cells induced by different concentrations of SHL表1 不同濃度SHL對(duì)Nalm6細(xì)胞周期的影響（n=3，%，）

均P＞0.05

組別空白對(duì)照組SHL 0.1 g/L組SHL 0.2 g/L組SHL 0.4 g/L組F G1期41.55±3.37 37.34±3.53 39.27±6.70 44.74±5.93 1.169 S期44.03±1.64 48.19±0.85 45.50±4.76 36.58±7.77 3.433 G2期14.42±4.85 14.48±3.24 15.23±6.67 18.59±1.99 0.567

Fig.3 Apoptosis of Nalm6 cells induced by different concentrations of SHL圖3 不同濃度SHL對(duì)Nalm6細(xì)胞凋亡的影響

2.4 不同濃度SHL 誘導(dǎo)Nalm6 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變 Nalm6 細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33342 熒光染色后發(fā)現(xiàn)，SHL處理24 h后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的藍(lán)色顆粒熒光，呈現(xiàn)核固縮、核碎裂等細(xì)胞核形態(tài)改變，見(jiàn)圖4?？瞻讓?duì)照組及SHL 0.1、0.2、0.4 g/L 組凋亡細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）分別為0.33±0.58、5.67±1.53、10.33±1.53、18.67±2.52。與空白對(duì)照組相比，SHL 各劑量組細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多（F=63.950，P＜0.01）。

2.5 不 同 濃 度 SHL 對(duì) Nalm6 細(xì) 胞 tBid、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9 和 cleaved PARP 蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)SHL處理24 h后，與空白對(duì)照組相比，SHL 0.1、0.2、0.4 g/L 組的tBid、cleaved Caspase-9、cleaved PARP 蛋白表達(dá)升高，SHL 0.2、0.4 g/L組cleaved Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高。SHL 0.1～0.4 g/L 濃度范圍內(nèi)，隨著處理濃度的升高，tBid、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)水平逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表2。

Fig.4 Morphological changes of Nalm6 cell apoptosis induced by different concentrations of SHL(×400)圖4 不同濃度SHL誘導(dǎo)Nalm6細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化（×400）

Fig.5 Effects of different concentrations of SHL on expression levels of apoptosis related proteins in Nalm6 cells圖5 不同濃度SHL對(duì)Nalm6細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

Tab.2 Changes in apoptosis-related proteins induced by different concentrations of SHL in Nalm6 cells表2 不同濃度SHL誘導(dǎo)Nalm6細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化（n=3，）

Tab.2 Changes in apoptosis-related proteins induced by different concentrations of SHL in Nalm6 cells表2 不同濃度SHL誘導(dǎo)Nalm6細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組比較，b與SHL 0.1 g/L 組比較，c與SHL 0.2 g/L組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組SHL 0.1 g/L組SHL 0.2 g/L組SHL 0.4 g/L組F tBid 0.51±0.03 0.67±0.02a 0.78±0.01ab 0.83±0.05abc 1284.000＊＊cleaved Caspase-9 0.10±0.02 0.50±0.03a 0.85±0.05ab 0.92±0.02abc 401.800＊＊cleaved Caspase-3 0.13±0.02 0.16±0.03 0.19±0.02ab 0.25±0.01abc 22.320＊＊cleaved PARP 0.31±0.01 0.46±0.02a 0.59±0.01ab 0.67±0.04abc 928.500＊＊

2.6 不同濃度SHL對(duì)Nalm6細(xì)胞中MEK-ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示，經(jīng)SHL 處理24 h 后，與空白對(duì)照組相比，SHL 0.1、0.2、0.4 g/L 組 p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、c-Myc 蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.05）；0.1～0.4 g/L 范圍內(nèi)，隨著SHL 濃度的升高，p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、c-Myc蛋白表達(dá)逐漸下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6、表3。

Fig.6 Effects of different concentrations of SHL on expression levels of MEK-ERK signaling pathway proteins in Nalm6 cells圖6 不同濃度SHL對(duì)Nalm6細(xì)胞MEK-ERK信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

Tab.3 SHL induced changes in MEK-ERK signaling pathway proteins in Nalm6 cells表3 不同濃度SHL誘導(dǎo)Nalm6細(xì)胞中MEK-ERK信號(hào)通路蛋白的變化 （n=3，）

Tab.3 SHL induced changes in MEK-ERK signaling pathway proteins in Nalm6 cells表3 不同濃度SHL誘導(dǎo)Nalm6細(xì)胞中MEK-ERK信號(hào)通路蛋白的變化 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組比較，b與SHL 0.1 g/L 組比較，c與SHL 0.2 g/L組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組SHL 0.1 g/L組SHL 0.2 g/L組SHL 0.4 g/L組F p-MEK/MEK 0.87±0.01 0.75±0.02a 0.46±0.01ab 0.29±0.02abc 785.400＊＊p-ERK/ERK 0.82±0.03 0.77±0.01a 0.67±0.02ab 0.37±0.01abc 1 927.000＊＊c-Myc 0.79±0.01 0.59±0.02a 0.42±0.01ab 0.35±0.03abc 1 585.000＊＊

2.7 凋亡抑制劑Z-VAD-FMK 對(duì)SHL 凍干粉誘導(dǎo)Nalm6 細(xì)胞凋亡的影響 Z-VAD-FMK 是泛凋亡抑制劑，在加或不加Z-VAD-FMK（20 μmol/L）預(yù)處理4 h 的 Nalm6 細(xì)胞中加入 SHL（0.2 g/L）處理 24 h 后，細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，在Z-VAD-FMK 未預(yù)處理Nalm6 細(xì)胞中，SHL 作用后的細(xì)胞總凋亡率為（64.42±3.71）%，而 Z-VAD-FMK 預(yù)處理的細(xì)胞在SHL作用后的細(xì)胞總凋亡率為（31.15±1.10）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.892，P＜0.05），見(jiàn)圖7。

3 討論

目前急性B淋巴細(xì)胞白血病的治療手段主要是聯(lián)合化療，但患者用藥后不良反應(yīng)大，易產(chǎn)生耐藥。本研究通過(guò)CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證實(shí)SHL可以抑制急性白血病細(xì)胞（Nalm6 Jurkat、Molt4、KG1a）增殖，誘導(dǎo)急性B 淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞（Nalm6）凋亡，推測(cè)其可能具有抗白血病的作用。

凋亡細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)聚集，經(jīng)核碎裂形成大小不等的染色質(zhì)塊，然后整個(gè)細(xì)胞通過(guò)出芽、起泡等方式形成一個(gè)球形凋亡小體，凋亡小體的形成是細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志［14］。本研究通過(guò) Hoechst 33342 熒光染色后觀察到隨著SHL 處理濃度增加，Nalm6 凋亡細(xì)胞明顯增多。凋亡又分為外源性凋亡和內(nèi)源性凋亡［15］。在本研究中，Nalm6經(jīng)SHL處理后，促凋亡相關(guān)蛋白tBid、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3以及cleaved PARP 表達(dá)均顯著增高。tBid是由于外源性凋亡途徑中Capsase-8 對(duì)Bid 進(jìn)行切割以后形成的，隨后tBid 轉(zhuǎn)移到線粒體外膜（OMM）上激活Caspase-9依賴的活化結(jié)構(gòu)［15］，從而激活Caspase-9-Caspase-3 級(jí)聯(lián)反應(yīng)使 PARP 增加［16］，導(dǎo)致外源性細(xì)胞凋亡。因此，SHL 可能通過(guò)外源性凋亡途徑誘導(dǎo)Nalm6 凋亡；同時(shí)，用凋亡抑制劑 Z-VAD-FMK 預(yù)處理Nalm6后再加用SHL，Nalm6細(xì)胞凋亡率較單獨(dú)使用SHL處理組下降，凋亡被抑制，再次確認(rèn)SHL誘導(dǎo)Nalm6細(xì)胞的死亡方式可能是通過(guò)細(xì)胞凋亡。

MAPKs 家族蛋白由 ERK1/2、p38、c-Jun 氨基末端激酶（JNK12-13）和ERK5等分子組成。這些絲氨酸/蘇氨酸激酶可被 MEK 激活，而 MEK1 和 MEK2 是ERK1/2的特定激活劑［17］。c-Myc作為MEK-ERK信號(hào)通路下游的靶基因，其活性增加會(huì)促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲［18］。MEK-ERK 信號(hào)通路的激活最終促進(jìn)了癌細(xì)胞增殖、遷移和血管生成［19］，目前已有2 種MEK 抑制劑（trametinib 和cobimetinib）被批準(zhǔn)用于臨床治療，而ERK抑制劑仍在進(jìn)行臨床試驗(yàn)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，SHL可以通過(guò)抑制MEK-ERK 信號(hào)通路，下調(diào)Nalm6 細(xì)胞中c-Myc 蛋白的表達(dá)。因此，SHL有可能作為治療急性細(xì)胞白血病的潛在藥物，但SHL進(jìn)入細(xì)胞后的具體的作用靶點(diǎn)及其機(jī)制仍需要深入探究。

Fig.7 Effects of Z-VAD-FMK on apoptosis of SHL-treated Nalm6 cells圖7 Z-VAD-FMK對(duì)SHL誘導(dǎo)Nalm6細(xì)胞凋亡的影響

綜上所述，SHL可抑制Nalm6細(xì)胞增殖，并通過(guò)上調(diào)tBid、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3以及cleaved PARP 等相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與抑制MEK-ERK 信號(hào)通路有關(guān)。