短期干旱脅迫對桔梗生理生態(tài)及其皂苷含量的影響

李 敏， 張 萌， 王士杰， 程 林， 韓 梅*， 楊利民*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院，吉林 吉林 132101)

桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq.) A.DC.是一種傳統(tǒng)的中草藥。桔梗主要種植在我國安徽、河北、河南、四川、江蘇和內(nèi)蒙古等干旱半干旱地區(qū)[1]。桔梗作為保健食品和中藥，用于治療咳嗽、痰多、喉痛等病癥[2]。三萜皂苷廣泛存在于中草藥中，以游離形式存在或以糖苷或酯結(jié)合糖的形式存在。藥理學(xué)研究證明，桔梗皂苷為其主要的有效成分，具有抗腫瘤、降血糖、抗肥胖等多種藥理活性[3]，其中桔梗皂苷D(platycodin D，PD)與去芹糖桔梗皂苷D(deapio-platycodin D，DPD)為桔梗中的主要活性成分，具有抑制胰脂肪酶和抗腫瘤活性[4-5]。

植物次生代謝產(chǎn)物決定了藥材的質(zhì)量，而植物次生代謝產(chǎn)物本身也受到脅迫條件的影響，尤其是干旱對藥物質(zhì)量的影響較大[6]。在栽培過程中，可以通過干旱脅迫等多種途徑增加藥用植物的次生代謝產(chǎn)物[7]。適度的干旱脅迫有利于桔梗幼苗總皂苷的積累[8]。到目前為止，桔梗適應(yīng)干旱的生理機(jī)制尚未全面闡明，為了探究桔梗在短期干旱脅迫下的生理反應(yīng)，如光合作用、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、抗性酶系統(tǒng)及桔梗皂苷積累等情況，本實(shí)驗(yàn)對2年生桔梗進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為提高桔梗品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)桔梗的生態(tài)種植提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1 藥材 實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)選在吉林省長春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物栽培育種及生理生態(tài)調(diào)控實(shí)踐教學(xué)基地。成熟的桔梗種子采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院楊利民教授鑒定為桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq.) A.DC. 種子。選擇大小一致、飽滿、無病蟲害的種子，種植在同一規(guī)格花盆中(上口徑32 cm，下口徑28 cm，深度25 cm)。每盆裝5 kg混有有機(jī)肥的土壤。試驗(yàn)土壤為疏松的砂壤土，透氣排水性能良好，有機(jī)質(zhì)18.42 g/kg、堿氮108.15 mg/kg、速效磷39.86 mg/kg、速效鉀98.65 mg/kg。定株，定期進(jìn)行管理，包括除草、除蟲、澆水等。

1.2 試劑及儀器 PRO測定試劑盒、MDA測定試劑盒、SOD酶活性測定試劑盒、POD酶活性測定試劑盒、CAT酶活性測定試劑盒、可溶性糖測試劑盒、可溶性蛋白測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。桔梗皂苷對照品購于上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；水為雙重蒸餾水；其他試劑為國產(chǎn)分析純。MDF-382E超低溫冰箱(日本SANYO公司)；高速離心機(jī)(美國Thermo公司)；SpectraMax 190酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；Agilent1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；LCpro+便攜式光合儀(英國 ADCBioScientific Ltd.公司)；調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(英國 Hansatech公司)。

2 方法

2.1 短期干旱脅迫試驗(yàn) 在短期干旱脅迫試驗(yàn)前的半個月，每個花盆每2 d灌溉1次，以保證水分條件一致。2018年9月5日，開展干旱脅迫試驗(yàn)。將60盆生長良好、一致性好、無病蟲害的桔梗植株隨機(jī)分為干旱組和對照組，每組30盆。干旱組的土壤在試驗(yàn)開始前(2018年9月4日)一次性灌溉至飽和，土壤含水量約為33.7%。而后干旱組在連續(xù)干旱處理中不再澆水，直到桔梗的葉子枯萎。對照組根據(jù)長春地區(qū)近10年的9月份平均降雨量，每2 d澆一次水，澆水量為800 cm3，土壤含水量控制在16% ～18%，以保證桔梗的正常生長發(fā)育。在12 d，桔梗的葉子開始枯萎，下午6點(diǎn)再向干旱組供水。此后干旱組與對照組的管理相同，直至2018年10月30日秋季(HT)統(tǒng)一收獲。

在干旱脅迫實(shí)驗(yàn)中，分別在第3、6、9、12、15、18天以及秋季進(jìn)行了取樣。每次取樣時隨機(jī)選擇3盆，去泥沙、清洗、瀝干水分后，取部分桔梗根組織，貯存于-80 ℃超低溫冷藏箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。剩余部分桔梗根置于烘箱中，65 ℃烘干至恒定質(zhì)量，用高速萬能打粉機(jī)磨成細(xì)粉，過60目篩，用于桔梗皂苷的測定。

2.2 桔梗皂苷含量測定 稱取桔梗根粉末200 mg，80%甲醇在60 ℃下超聲提取3次，每次20 min，蒸發(fā)溶劑，將殘?jiān)?0%甲醇溶解稀釋至10.0 mL量瓶中，0.45 μm微孔濾膜過濾，取上清液。

分析采用Promasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動相乙腈 (A)-0.2% 甲酸(B)，梯度洗脫(0～15 min，20%A；15～60 min，22%A；60～65 min，30%A；65～70 min, 20% A，最后用20%A運(yùn)行5 min)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。漂移管溫度75 ℃；載氣(N2)體積流量2.5 L/min。制備含桔梗皂苷D(PD)、去芹糖-桔梗皂苷D(DPD)和桔梗皂苷D3(DP3)的甲醇溶液母液，稀釋至適當(dāng)濃度，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得PD、DPD、PD3的回歸方程分別為logY=0.611 5logX-3.324 6(r=0.999 9)、logY=0.6004logX-3.341 1(r=0.999 9)、logY=0.596 9logX-3.269 1 (r=0.999 8)。色譜圖見圖1。

1.桔梗皂苷D3 2.去芹糖-桔梗皂苷D 3.桔梗皂苷 D

2.3 光合作用及葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 在桔梗短期干旱脅迫期間，每個處理隨機(jī)選取長勢相似的植株15株，掛牌，于2018年9月4日開始，每隔3 d，上午 8：30～11：30 采用Li-6400便攜式光合儀對桔梗葉片進(jìn)行光合參數(shù)測定，同時采用PAM-2100便攜式葉綠素?zé)晒鈨x測定桔梗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行測定。

2.4 生理生化指標(biāo)測定 PRO、MDA、SOD、POD、CAT、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)含量測定均按照試劑盒操作規(guī)程進(jìn)行操作，并計(jì)算各指標(biāo)水平。

2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2013對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 22.0、GraphPad Prism 7.0、OriginPro進(jìn)行分析和作圖。

3 結(jié)果

3.1 土壤水分變化 土壤含水量變化見圖 2，可知在短期水分脅迫開始后，處理組土壤含水量由處理開始時的 33.5%，不斷下降到12 d后的8.5%，13 d開始進(jìn)行復(fù)水處理，使處理組土壤水分恢復(fù)到與對照組相同水平(16%～18%)。

圖2 短期干旱脅迫下土壤水分含量變化

3.2 短期干旱脅迫對桔梗光合指標(biāo)參數(shù)影響 短期干旱脅迫對桔梗葉片光合特性的影響見圖3，可知隨著土壤含水量的降低，桔梗的WUE和Pn均呈下降趨勢，Ls和Ci在干旱初期增加，后期逐漸下降；處理組Pn、WUE和Ci均低于對照組，處理組Ls在干旱初期高于對照組(P<0.01)；復(fù)水后，桔梗的WUE、Ci和Ls得到了恢復(fù)，短期內(nèi)觀察發(fā)現(xiàn)，處理組與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 短期干旱脅迫對桔梗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 桔梗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)受到短期干旱脅迫的影響見圖4，可知隨著干旱程度加重，桔梗葉片F(xiàn)v/Fm和φPSⅡ逐漸降低，并在干旱的12 d分別降到最低0.733和0.31(P<0.01)，提示桔梗在受到干旱影響后光能的利用力減弱；在干旱處理下桔梗的NPQ亦也受到影響，在開始干旱的6 d，NPQ升高(P<0.05)，之后逐漸下降，復(fù)水后仍未能達(dá)到對照組的正常水平，而qP受干旱影響不明顯。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 短期干旱脅迫對桔梗根保護(hù)酶活性的影響 短期干旱處理對桔梗根部保護(hù)酶活性的影響結(jié)果見圖5，可知在短期干旱處理過程中，對3種保護(hù)酶SOD、POD、CAT活性均有影響，其中在整個實(shí)驗(yàn)階段，處理組SOD與POD活性變化趨勢與對照組基本一致；在開始干旱的3、6 d，SOD活性低于對照組(P<0.05，P<0.01)，隨著干旱程度的增加，處理組SOD活性不斷提高，并在9、12 d活性高于對照組(P<0.05)，復(fù)水后出現(xiàn)降低，但仍高于對照組；POD除了3、18 d外，在整個實(shí)驗(yàn)過程總，處理組均高于對照組(P<0.05)；CAT活性受干旱影響較大，在干旱3 d時，處理組低于對照組(P<0.01)，然后隨著干旱的加重，處理組急劇增加并高于對照組，復(fù)水后雖然略有下降，但仍高于對照組。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 短期干旱脅迫對桔梗根滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響 短期干旱對桔梗根部滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和丙二醛水平的影響結(jié)果見圖6，可知在實(shí)驗(yàn)過程中，處理組與對照組的SP和PRO水平變化趨勢基本一致，SP呈現(xiàn)逐漸升高后下降的趨勢，且隨著干旱程度增加，處理組在干旱最嚴(yán)重的12 d達(dá)到最大值為 7.636 mg/g(P<0.05)，在復(fù)水后SP水平有所下降但仍高于對照組(P<0.05)，PRO整個實(shí)驗(yàn)過程中，處理組均高于對照組，桔梗根部PRO水平在干旱的3 d增加，在6、9 d下降，在干旱最嚴(yán)重的12 d又開始增加，并且復(fù)水后仍在上升；SS水平受干旱影響不明顯，僅在干旱比較嚴(yán)重的9 d和12 d高于對照組(P<0.05)，復(fù)水后2組間無顯著差異；MDA在開始干旱的3 d出現(xiàn)短暫的水平降低，隨后在干旱程度的加深過程中不斷累積，12 d達(dá)到最大值 25.289 nmol/g，在復(fù)水后MDA水平有所下降。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.6 短期干旱脅迫對桔梗皂苷含量變化的影響 短期干旱對桔梗皂苷含量的影響見圖7，可知桔梗皂苷含量可以反映出植物對水分變化的響應(yīng)程度，也是評價桔梗質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明，隨著土壤含水量的減少PD及DPD含量總體呈增長趨勢；在處理組中，PD及DPD總體趨勢相似，在9、12 d 重度干旱階段，其含量均增加，PD分別達(dá)到了130.526、119.542 μg/g，DPD分別達(dá)到了45.209、 45.45 μg/g，均高于對照組；在干旱脅迫實(shí)驗(yàn)過程中，兩組間PD3的含量變化并不明顯，但在秋季HT時對照組高于處理組(P<0.01)；PD、DPD含量在秋季HT時均高于對照組，說明干旱脅迫有利于桔梗主要皂苷類成分的積累。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.7 短期干旱脅迫下桔梗各指標(biāo)的相關(guān)分析及主成分分析 利用SPSS 22.0對短期干旱脅迫下桔梗皂苷與各生理指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見表1，可知光合參數(shù)中僅Pn與PD極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，Ls 與 DPD 為極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；葉綠素?zé)晒鈪?shù)中，F(xiàn)v/Fm與PD3有顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.05)，而φPSⅡ與 PD、DPD均為極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，可能因?yàn)楣夂献饔脜?shù)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)并未直接參與于桔梗根部皂苷的合成而起間接作用，故對 PD、PD3 及DPD 的生物合成影響較弱。植物保護(hù)酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中 SOD、SP、MDA 對 PD及 DPD 的合成有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，而其他生理指標(biāo)與桔梗皂苷的相關(guān)性并未達(dá)到顯著水平。

表1 短期干旱脅迫下桔梗皂苷與各生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

為了探討短期干旱對桔梗3種皂苷(PD、DPD、PD3)、光合作用(Pn、WUE、Ci、Ls)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、 φPSII、qP、NPQ)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(SP、PRO、SS)、MDA、保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)共18個指標(biāo)間的交互影響，基于主成分析構(gòu)建各指標(biāo)的雙標(biāo)圖，雙標(biāo)圖中的向量表示了指標(biāo)的信息，2個指標(biāo)間夾角的余弦的絕對值表示它們之間相關(guān)性的大小[9]，其值越大表明2個向量對應(yīng)的指標(biāo)之間相關(guān)性越高，當(dāng)2個向量近似垂直時，指標(biāo)之間相關(guān)性很弱，幾乎互不影響[10]。

對短期干旱脅迫下桔梗各指標(biāo)進(jìn)行主成分析并繪制雙標(biāo)圖，結(jié)果見圖8。根據(jù)18個主成分所保留原始變量信息的大小，提取2個主成分，其中PC1(第一主成分)和 PC2(第二主成分)差異顯著，對原始資料的解釋率分別為35.40%、21.87%，共計(jì)57.27%。圖8、表2 顯示，PC1與桔梗皂苷(PD、DPD、PD3)、WUE、Ci、qP、NPQ、3種保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)、MDA 及 SP 正相關(guān)，且Ci、SOD、CAT、SP、MDA、PD、DPD的變量系數(shù)較大，為正向主導(dǎo)變量，而Ls、Fv/Fm 和φPSⅡ?yàn)樨?fù)向主導(dǎo)變量；PC2中，WUE、POD和 PRO 的變量系數(shù)為較大且為正，為正向主導(dǎo)變量，負(fù)向變量系數(shù)Ls、SOD、SS、MDA、PD、DPD 中僅SS和PD變量絕對值較大，為負(fù)向主導(dǎo)變量。PC1 和 PC2 中這些主導(dǎo)變量可以反映18個變量的綜合指標(biāo)。

圖8 短期干旱脅迫下桔梗各指標(biāo)的主成分分析圖

表2 旋轉(zhuǎn)后因子載荷

4 討論與結(jié)論

在干旱脅迫發(fā)生后，植物會通過自身一系列理態(tài)學(xué)程和機(jī)理去防御和適應(yīng)脅迫。干旱處理對桔梗的光合特性及葉綠素?zé)晒鈪?shù)有一定的影響。處理組Pn、WUE和Ci均低于對照組，處理組Ls 在干旱初期高于對照組(P<0.05)。復(fù)水后的短期觀察發(fā)現(xiàn)，處理組與對照組桔梗Pn、WUE、Ci 和Ls無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Fv/Fm、φPSⅡ受到短期持續(xù)干旱的顯著影響，隨著干旱程度加重桔梗葉片F(xiàn)v/Fm和φPSⅡ逐漸降低，并在干旱的12 d分別降到最低0.733和0.31(P<0.01)，提示桔梗在受到干旱影響后光能的利用力減弱。

PRO、SP、SS 等作為滲透保護(hù)劑，在脅迫條件下植物的適應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處理組SP 干旱最嚴(yán)重的12 d達(dá)到最大值為7.636 mg/g(P<0.05)，復(fù)水后有所下降但仍高于對照組(P<0.05)。PRO 整個實(shí)驗(yàn)過程中，處理組均高于對照組。MDA在干旱脅迫條件下，其水平隨膜脂過氧化程度的增加而增加[12]。在桔梗短期干旱脅迫中，MDA水平在3 d出現(xiàn)短暫降低，隨著干旱程度加深不斷累積，12 d達(dá)到最大值 25.289 nmol/g。

干旱脅迫前期不同處理防風(fēng)SOD、POD、CAT 活性均呈增加趨勢[7]，當(dāng)植物受到脅迫后，植物的細(xì)胞和亞細(xì)胞系統(tǒng)通過 SOD、POX、CAT 等抗氧化酶來抵御活性氧自由基的細(xì)胞毒作用[13]；隨干旱程度增加，處理組SOD活性不斷提高，并在9、12 d 活性高于對照組(P<0.05)，復(fù)水后出現(xiàn)降低，但仍高于對照組；除了3、18 d 外，處理組POD均高于對照組；CAT隨干旱加重，處理組急劇增加并高于對照組，復(fù)水后仍高于對照組。以上結(jié)果說明，桔梗根部組織通過增加 SOD、POD、CAT 等抗氧酶活性來抵御干旱脅迫帶來的傷害。

適度的干旱脅迫有利于藥用植物次生代謝產(chǎn)物積累[14-16]，在受不同非生物脅迫的法國南部的大葉菊植物中觀察到大量倍半萜[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤水分含量的減少，PD及DPD含量總體呈增長趨勢，在 9、12 d 重度干旱階段其含量均高于對照組，動態(tài)變化可認(rèn)為是對抗干旱脅迫的防御機(jī)制。

綜上所述，本研究可為考察短期干旱脅迫對桔梗活性成分積累的影響提供依據(jù)，也能為進(jìn)一步探討該藥材對干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供參考。