HPLC法同時測定舒眠膠囊中4種成分

彭 瀟， 雷 艷， 陳思穎， 聶開品， 楊 純， 王愛民， 李勇軍*

(1.貴州醫(yī)科大學民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學，貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550004；4.貴州大隆藥業(yè)有限責任公司，貴州 貴陽 550004；5.畢節(jié)市第一人民醫(yī)院，貴州 畢節(jié) 551700)

舒眠膠囊為國家基本藥物目錄所收載的中藥復方制劑[1]，由酸棗仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合歡花等8味藥材組成，具有疏肝解郁、寧心安神的療效[2]，主要用于肝郁傷神所致的失眠癥，安全性和臨床療效較好，且應用廣泛[3-5]。方中酸棗仁含有的斯皮諾素等黃酮類物質具有鎮(zhèn)靜催眠及抗抑郁藥理作用[6]，白芍中芍藥苷、芍藥內酯苷等主要成分有抗驚厥等生物學效應，具有明顯的鎮(zhèn)靜、抗抑郁活性[7]，合歡花總黃酮有抗抑郁作用，其中槲皮苷為鎮(zhèn)靜催眠的有效成分[8-9]。舒眠膠囊現(xiàn)行標準收載于《國家藥品標準新藥轉正標準第33冊》，僅對制劑中芍藥苷進行了定量檢測[10]，而含多種有效活性成分的中藥復方制劑是通過多成分、多靶點聯(lián)合作用起療效，對其中某單一成分的定量檢測并不足以全面評估制劑的質量的優(yōu)劣及安全性、有效性與穩(wěn)定性，多組分評價模式已成為發(fā)展趨勢[11]。本實驗采用HPLC法同時測定舒眠膠囊中芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷的含量，以期為該制劑的質量控制和評價奠定實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；AE-240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；超純水機(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥 15批舒眠膠囊(每粒裝0.4 g，批號20160721、20160722、20160801、20171201、20171006、20171108、20171002、20170504、20170601、20170910、20170702、20170305、20170404、20170205、20170103)編號S1～S15，均由貴州大隆藥業(yè)有限責任公司提供。酸棗仁、柴胡、白芍、合歡花、合歡皮、蟬蛻、僵蠶、燈心草均由貴州大隆藥業(yè)有限責任公司提供，經(jīng)貴州醫(yī)科大學劉春花副教授鑒定為正品。芍藥內酯苷、芍藥苷、槲皮苷、斯皮諾素對照品均購于四川省維克奇生物科技有限公司，純度均≥98%，批號分別為wkq18050205、wkq18032104、wkq18041101、wkq18060104。乙腈為色譜純；甲醇、乙醇等試劑均為分析純；水為自制超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters CORTECS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脫(0～20 min，10%～15%A；20～30 min，15%～16%A；30～40 min，16%～18%A；40～42 min，18%～95%A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長242 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取上述4種對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含芍藥內酯苷2.362 mg、芍藥苷2.560 mg、斯皮諾素0.945 mg、槲皮苷2.040 mg的貯備液，精密量取適量，置于5 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL分別含四者0.755 8、0.819 2、0.075 6、0.204 0 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取膠囊內容物1 g，置于磨口具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質量，超聲(200 W、40 kHz)處理30 min，取出，放冷，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，取上清液，0.2 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方比例及制劑工藝，分別制成缺酸棗仁(炒)、缺白芍(炒)、缺合歡花的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 取“2.2”項下各溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，發(fā)現(xiàn)陰性無干擾，各成分分離度良好(R>1.5)，表明該方法專屬性良好，見圖1。

1.芍藥內酯苷 2.芍藥苷 3.斯皮諾素 4.槲皮苷

2.3.2 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，甲醇制成不同質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.3.3 精密度試驗 精密稱取膠囊(S3)內容物1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件進樣測定6次，測得芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷峰面積RSD分別為2.0%、1.0%、0.62%、0.68%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取膠囊(S3)內容物1 g，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件進樣測定，測得芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷含量RSD分別為1.8%、1.6%、1.4%、1.7%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取膠囊(S3)內容物1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷峰面積RSD分別為0.39%、0.49%、1.5%、0.85%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取4種成分含量已知的膠囊(S3)內容物6份，每份0.5 g，精密加入各對照品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗結果(n=6)

2.3.7 樣品含量測定 取15批膠囊，每批2份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果(n=2)

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法篩選 本實驗首先考察了回流、超聲提取，再考察了提取溶劑甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、水，最后考察了提取時間30、60、90、120 min，最終確定采用50%甲醇超聲提取30 min作為供試品溶液制備方法，此時指標成分提取率較高，峰形對稱性較好。

3.2 色譜條件篩選 本實驗首先考察了艾杰爾Venusil XBP(L) C18、沃特世 Waters CORTECS C18色譜柱，然后考察了流動相甲醇-水、甲醇-水(含0.1%磷酸)、乙腈-水(含0.1%磷酸)、乙腈-水(含0.1%甲酸)對色譜峰的影響，綜合考慮指標成分分離度與峰形，結合基線平穩(wěn)狀況，最終確定采用Waters CORTECS C18色譜柱，并以乙腈-水(含0.1%磷酸)進行梯度洗脫。同時參考文獻[12-13]結合二極管陣列檢測器DAD全波長掃描，發(fā)現(xiàn)芍藥內酯苷、芍藥苷在230 nm左右均有最大吸收，而且大于260 nm后兩者吸收均較弱；斯皮諾素、槲皮苷分別在260、345 nm左右有較大吸收，綜合考慮峰高，最終選用242 nm作為檢測波長，此時各成分峰形、分離度良好，陰性樣品無干擾，專屬性良好。

3.3 指標成分篩選 本實驗選擇芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷作為指標成分，均是發(fā)揮抗抑郁、鎮(zhèn)靜催眠的主要活性物質[14-16]，這與舒眠膠囊用于治療肝郁傷神所致失眠癥相符?，F(xiàn)代藥理研究表明，酸棗仁中以酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B為代表的皂苷類物質也為其鎮(zhèn)靜安神的主要藥效成分；柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D等也具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥理活性[17-18]，但該類成分在紫外檢測器上存在末端吸收，基線易漂移，受干擾較嚴重，故今后將采用蒸發(fā)光散射檢測器對其進行研究。

4 結論

本實驗建立HPLC法同時測定舒眠膠囊中芍藥內酯苷、芍藥苷、斯皮諾素、槲皮苷的含量，該方法簡便準確，具有良好的精密度、重復性、穩(wěn)定性，可為該制劑質量標準的完善和提高奠定實驗依據(jù)。