乳糖酸修飾的黃芩苷自組裝膠束載藥系統(tǒng)的制備及體外評價

邵艷尋，郭切切，張舒迪，楊雅欣，龔法伍，劉占軍

華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 063210

中醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)許多中藥材能抑制和減輕化療藥物產(chǎn)生的不良反應(yīng)，提高治療效果[1-2]。黃芩苷（baicalin，BC）是黃芩的主要有效成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜、降壓、免疫抑制等藥理作用[3-4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，黃芩苷主要影響腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性凋亡，通過多種信號通路影響B(tài)淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）家族蛋白、細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-9等蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。黃芩苷雖有諸多優(yōu)勢，但其水溶性較差，生物利用度低[7]。目前已經(jīng)開發(fā)了一系列載黃芩苷的納米制劑，包括固體脂質(zhì)納米粒、磷脂復(fù)合物、共沉淀物、納米乳[8-12]等，但存在工藝復(fù)雜、載藥量低等問題。阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種蒽環(huán)類拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，可通過下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)以及誘導(dǎo)Wnt通路抑制劑的表達(dá)來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。但是通過單獨應(yīng)用阿霉素，常會因為其較差的器官選擇性而引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷在肝癌、肺癌、乳腺癌等癌癥的化療中具有輔助治療的作用，可以減輕不良反應(yīng)，增強(qiáng)抗癌效果。

自組裝膠束作為納米藥物載體，具有內(nèi)核疏水外殼親水的結(jié)構(gòu)，能改善難溶性藥物的溶解性并實現(xiàn)持續(xù)、緩慢的藥物釋放[13]。針對膠束增溶能力強(qiáng)、粒徑小、循環(huán)時間長等優(yōu)點[14-16]，可通過尋找合適的載體材料設(shè)計開發(fā)載黃芩苷和阿霉素膠束。O-羧甲基殼聚糖（O-carboxymethyl chitosan，OCMC）保留了殼聚糖骨架大量的活性氨基，可用于化學(xué)修飾進(jìn)行改造[17-19]。由于骨架上同時具有氨基和羧基，在水介質(zhì)中有兩親性聚電解質(zhì)的特性，在骨架上通過疏水修飾可以獲得具有pH值敏感的殼聚糖自組裝膠束體系。例如將疏水性藥物小分子偶聯(lián)到OCMC骨架上構(gòu)建自組裝前藥膠束[20]。

乳糖酸（lactobionic acid，LA）可被肝實質(zhì)細(xì)胞膜上的ASGP-R受體特異性識別并通過內(nèi)吞作用快速攝取[21-22]，將其修飾到骨架上會增強(qiáng)載體的靶向遞送能力。因而本研究設(shè)計合成CMBC及LACMBC，并以LA-CMBC為載體制備負(fù)載阿霉素的自組裝膠束，對其制劑學(xué)性質(zhì)及體外抗腫瘤活性進(jìn)行考察，以期實現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，為中藥與化療藥物的協(xié)同抗肝癌研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

FTIR-8400S紅外光譜分析儀，日本島津公司；ZEN3690型激光粒度分析儀，英國Malvern儀器公司；F-320熒光分光光度計，天津港東科技股份有限公司；布魯克600兆核磁共振波譜儀，德國布魯克儀器公司；JEM-2800F型聚焦雙束掃描電子顯微鏡（SEM），美國FEI儀器有限公司；Lambda 35紫外可見光分光光度計，珀金埃爾默儀器有限公司；iMark全自動酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司。

黃芩苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%，批號21967-41-9）、N-羥基琥珀酸亞胺（NHS，分析純）、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl，分析純）、乳糖酸（分析純）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF，分析純）、二甲基亞砜（DMSO，分析純）、無水乙醇（分析純）均購于阿拉丁有限公司；OCMC，脫乙酰度＞90%，浙江澳興生物科技有限公司；鹽酸阿霉素，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠；DMEM高糖培養(yǎng)基（Eallbio，批號NG190320EL）、胰酶（Eallbio，批號N190823CF）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，Eallbio，批號190114）均購于北京中生奧邦生物科技有限公司；胎牛血清，天津康源生物技術(shù)有限公司；人肝癌細(xì)胞HepG2受贈于華北理工大學(xué)的齊亞娟教授實驗室。

2 方法與結(jié)果

2.1 CMBC的合成

根據(jù)文獻(xiàn)方法[13]利用EDC/NHS介導(dǎo)的酰胺化反應(yīng)，將黃芩苷偶聯(lián)到OCMC骨架上合成CMBC。稱?。?6～189 mg黃芩苷，0.2～0.5 mol OCMC）的黃芩苷溶解于DMF中，超聲溶解水浴加熱至60 ℃，加入相當(dāng)于黃芩苷2倍物質(zhì)的量的EDC和NHS進(jìn)行活化，攪拌30 min即得黃芩苷NHS活性酯溶液。另稱取200 mg OCMC溶于蒸餾水中，60 ℃攪拌溶解，加入等量的DMF稀釋，攪拌均勻。然后逐滴加入上述制備的黃芩苷活性酯溶液，60 ℃反應(yīng)4 h后室溫下繼續(xù)反應(yīng)24 h。反應(yīng)液用透析袋（相對分子質(zhì)量8000～14 000）在蒸餾水介質(zhì)中透析72 h，凍干即得CMBC。通過控制黃芩苷和OCMC的投料比，可以獲得不同黃芩苷取代度的CMBC。

2.2 LA-CMBC的合成

稱取76 mg（0.25 mol OCMC）的乳糖酸溶于5 mL蒸餾水中溶解，加入相當(dāng)于乳糖酸2倍物質(zhì)的量的EDC和NHS攪拌30 min使乳糖酸的羧基活化。另取凍干的CMBC溶于蒸餾水中，攪拌過夜，將活化后的乳糖酸逐滴加入到CMBC水溶液中，室溫攪拌48 h后，反應(yīng)液用透析袋在蒸餾水介質(zhì)中透析48 h，凍干即得LA-CMBC。合成路線見圖1。

圖1 CMBC和LA-CMBC的合成過程Fig.1 Synthesis of CMBC and LA-CMBC

2.3 偶聯(lián)物的表征及結(jié)果

2.3.1 核磁共振氫譜（1H-NMR）檢測及結(jié)果 以氘代DMSO和D2O為溶劑，分別對黃芩苷、OCMC進(jìn)行1H-NMR分析；以混合溶劑（D2O-氘代DMSO 1∶1）對CMBC和LA-CMBC進(jìn)行1H-NMR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圖2中OCMC在δ3.29～4.00顯示出糖環(huán)骨架質(zhì)子較寬的吸收峰。δ2.00處的特征峰歸屬于N-乙酰葡萄糖胺上的甲基氫。相比于OCMC在δ6.75～8.00出現(xiàn)的新的吸收峰，歸屬于黃酮類母核上的氫，其中在δ6.11～7.40處是苯環(huán)上氫的吸收峰，證實了黃芩苷成功地偶聯(lián)到了OCMC骨架上。圖2顯示乳糖酸偶聯(lián)至CMBC之后，在δ3.34～4.32出現(xiàn)了許多新的小峰，歸屬于乳糖酸環(huán)上的亞甲基峰。

圖2 OCMC、CMBC和LA-CMBC的1H-NMRFig.2 1H-NMR spectrum of OCMC, CMBC and LA-CMBC

2.3.2 紅外光譜（IR）檢測及結(jié)果 采用IR法對OCMC、CMBC和LA-CMBC進(jìn)行表征。結(jié)果（圖3）顯示，OCMC在1602 cm-1的特征吸收譜帶為酰胺II譜帶，對應(yīng)于伯氨基上N-H的彎曲振動，酰胺I譜帶是C＝O的伸縮振動吸收峰，波數(shù)稍高（1650 cm-1），由于1602 cm-1處吸收峰較大，因此使得酰胺I譜帶和酰胺II譜帶的吸收峰區(qū)分并不明顯，說明OCMC的脫乙?；潭容^高，活性氨基較多。產(chǎn)物CMBC與OCMC圖譜相比，出現(xiàn)了2個區(qū)分明顯的吸收峰，位于1602 cm-1的酰胺II譜帶吸收峰強(qiáng)度明顯降低，而位于1650 cm-1的酰胺I譜帶吸收峰則相反的呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢，說明形成了更多的酰胺鍵，使得黃芩苷與OCMC骨架偶聯(lián)。終產(chǎn)物L(fēng)ACMBC與CMBC相比，位于1602 cm-1的酰胺II譜帶吸收峰強(qiáng)度進(jìn)一步降低，而酰胺I譜帶進(jìn)一步增強(qiáng)，因此同樣證實乳糖酸也是通過酰胺鍵與OCMC骨架偶聯(lián)的。

圖3 OCMC、CMBC和LA-CMBC的IR圖Fig.3 Infrared spectrum of OCMC, CMBC and LA-CMBC

2.3.3 CMBC取代度的測定及結(jié)果

（1）黃芩苷分析方法的建立：采用紫外分光光度法測定黃芩苷的取代度。以無水乙醇為溶劑，配制一定質(zhì)量濃度的黃芩苷溶液，在200～600 nm進(jìn)行紫外光譜掃描。取少量OCMC、CMBC水溶液，分別用無水乙醇稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖4。

圖4 黃芩苷、CMBC和OCMC的紫外掃描圖譜Fig.4 UV scanning atlas of baicalin, CMBC and OCMC

可以看出，黃芩苷有2處明顯吸收，最大吸收波長是278 nm。而OCMC在此范圍內(nèi)均無吸收，說明OCMC材料對黃芩苷的紫外吸收沒有任何影響。而且，偶聯(lián)物CMBC顯示出了跟黃芩苷峰形一致的吸收。因此，可以確定將278 nm作為檢測CMBC中黃芩苷含量的檢測波長，且進(jìn)一步證明了黃芩苷成功修飾到了OCMC骨架材料上。

（2）黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：以無水乙醇為溶劑，配制質(zhì)量濃度分別為4.10、5.13、6.15、7.18、8.20、9.23 μg/mL的黃芩苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于278 nm處測定各吸光度值?；貧w方程為Y＝0.074 1X－0.043 3，r2＝0.997 4。

（3）黃芩苷取代度的測定結(jié)果：黃芩苷的取代度規(guī)定為每100個OCMC重復(fù)單元中氨基連接黃芩苷的個數(shù)。在CMBC合成中，通過控制黃芩苷和OCMC的投料比可以得到不同取代度的CMBC，即CMBC-1、CMBC-2、CMBC-3。稱取3種CMBC各1 mg至5 mL量瓶中，無水乙醇溶解定容，分別在278 nm下測定吸光度，計算取代度。

取代度＝mMOCMC/(m樣品－m)M黃芩苷

m指通過黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的CMBC偶聯(lián)物中黃芩苷的質(zhì)量，M黃芩苷指黃芩苷的相對分子質(zhì)量；m樣品指加入的CMBC總質(zhì)量，MOCMC指OCMC單位糖單元的摩爾分?jǐn)?shù)

從表1中看出，在黃芩苷投料比達(dá)到0.35時，已經(jīng)有足夠多的黃芩苷偶聯(lián)到了OCMC上。因此，在偶聯(lián)乳糖酸時為了能有較多的乳糖酸偶聯(lián)到CMBC產(chǎn)物上，選用CMBC-2用于乳糖酸的接枝。

表1 黃芩苷和OCMC投料比及黃芩苷的取代度 ( ,n = 3)Table 1 Feeding ratio of baicalin and OCMC and substitution degree of BC ( , n = 3)

表1 黃芩苷和OCMC投料比及黃芩苷的取代度 ( ,n = 3)Table 1 Feeding ratio of baicalin and OCMC and substitution degree of BC ( , n = 3)

樣品 黃芩苷與OCMC物質(zhì)的量比 取代度/%CMBC-1 0.20∶1 8.3±0.8 CMBC-2 0.35∶1 12.5±1.1 CMBC-3 0.50∶1 14.2±1.6

2.4 自組裝膠束的制備及表征

采用透析-超聲法制備自組裝膠束。由于CMBC和LA-CMBC均為兩親性偶聯(lián)物，所以兩者在水中透析的過程中就會自組裝形成納米膠束，為了使納米顆粒分散均勻，再用探頭式超聲在冰浴條件下超聲處理3次，每次處理2 min，超聲程序設(shè)置為開2 s停4 s，超聲功率為120 W。然后過0.45 μm的濾膜，即得自組裝膠束（圖5），于4 ℃冰箱保存。

圖5 CMBC膠束 (左)、LA-CMBC膠束 (中) 和LACMBC凍干物 (右)Fig.5 CMBC micelles (left), LA-CMBC micelles (middle),and LA-CMBC lyophilized products (right)

采用激光粒度電位分析儀測定膠束的粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）和Zeta電位，結(jié)果見表2和圖6。采用SEM觀察膠束的形貌大小，結(jié)果見圖7。

圖6 CMBC-2 (A)、LA-CMBC-2 (B) 的粒徑分布 (I) 和Zeta電位 (II)Fig.6 Particle size distribution (I) and Zeta potential (II) of CMBC-2 (A) and LA-CMBC-2 (B)

圖7 CMBC-2 (A)、LA-CMBC-2 (B) 的掃描電鏡圖Fig.7 SEM images of CMBC-2 (A) and LA-CMBC-2 (B)

表2 3種不同取代度的CMBC和LA-CMBC的粒徑、PDI和Zeta電位 ( , n = 3)Table 2 Partical size, PDI and Zeta potential of CMBC and LA-CMBC with three different degree of substitution( , n = 3)

表2 3種不同取代度的CMBC和LA-CMBC的粒徑、PDI和Zeta電位 ( , n = 3)Table 2 Partical size, PDI and Zeta potential of CMBC and LA-CMBC with three different degree of substitution( , n = 3)

樣品 取代度/%粒徑/nm PDI Zeta電位/mV CMBC-1 8.3 215.0±4.8 0.112±0.030 -17.02±0.29 CMBC-2 12.5 181.1±3.7 0.094±0.021 -17.16±0.75 CMBC-3 14.2 164.7±6.5 0.163±0.035 -17.24±0.82 LA-CMBC-2 - 156.3±6.4 0.131±0.087 -14.47±0.51

3種CMBC膠束粒徑在164～215 nm，隨著黃芩苷取代度的增加，膠束粒徑逐漸減小。這是因為疏水基團(tuán)越多，形成的疏水性內(nèi)核就更緊密，粒徑更小。LA-CMBC-2膠束粒徑約為156 nm，可以滿足肝靶向制劑要求，粒徑小于CMBC-2膠束，推測可能是水溶性乳糖酸的引入使OCMC骨架柔性增強(qiáng)，更易彎曲纏繞成粒徑更小的粒子。2自組裝體系均顯示出負(fù)值的Zeta電位，說明在自組裝的過程中，帶負(fù)電荷的親水性O(shè)CMC可以較為均勻的分布在偶聯(lián)物的表面，也間接證實了自組裝體系的形成。通過SEM觀察到的自組裝膠束為形狀較規(guī)則的類球形，粒徑大小較均一，實際觀察到的粒徑約為150 nm，比粒度電位分析儀測定的粒徑稍小。這是因為SEM樣品在預(yù)處理過程中因干燥導(dǎo)致粒子失水，從而使電鏡下呈現(xiàn)的粒徑比其在粒度儀（水介質(zhì)體系）中的數(shù)據(jù)要稍小一些，此現(xiàn)象與文獻(xiàn)報道一致[23]。

2.5 臨界膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）的測定及結(jié)果

LA-CMBC在水中的自組裝行為采用芘熒光探針法進(jìn)行考察。配制質(zhì)量濃度為0.012 mg/mL的芘溶液和1 mg/mL的LA-CMBC母液。取8個棕色樣品瓶，各加入100 μL芘溶液，氮氣吹干后各加入不同體積的LA-CMBC母液，蒸餾水定容至10 mL。使所配制的系列溶液質(zhì)量濃度分別為0.001、0.005、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500 mg/mL。水浴超聲40 min，室溫避光靜置8 h。熒光分光光度計的激發(fā)波長為334 nm，測定各溶液中芘的熒光吸收，將芘的第3個峰的譜帶強(qiáng)度與第1個峰的譜帶強(qiáng)度之比（I3/I1）對質(zhì)量濃度的對數(shù)做圖，交點處對應(yīng)的質(zhì)量濃度即為膠束的CMC值。

測得LA-CMBC膠束的CMC值為（0.081±0.019）mg/mL（圖8），說明LA-CMBC在水中容易聚集形成納米粒，并且進(jìn)入血管后可以抵抗大量的血液稀釋，是一種良好的兩親性偶聯(lián)物。

圖8 芘發(fā)射光譜熒光強(qiáng)度比值I3/I1和膠束質(zhì)量濃度（C）的對數(shù)關(guān)系圖 ( , n = 3)Fig.8 Logarithmic relationship between pyrene emission spectral fluorescence intensity ratio I3/I1 and micelle concentration ( , n = 3)

2.6 載藥膠束DOX/LA-CMBC的制備、含量測定、體外釋放及結(jié)果

2.6.1 載藥膠束的制備 采用透析法制備DOX/LA-CMBC膠束。稱取DOX·HCl 3 mg溶于5 mL DMSO，加入2倍物質(zhì)的量的三乙胺進(jìn)行脫鹽酸處理，避光攪拌過夜。另取LA-CMBC 10 mg溶于5 mL蒸餾水，攪拌過夜使之充分溶脹溶解。將阿霉素溶液緩慢滴加到LA-CMBC水溶液中，繼續(xù)避光攪拌24 h后對蒸餾水透析24 h。將溶液用探頭超聲處理，過0.45 μm濾膜即得。

2.6.2 阿霉素含量測定方法的建立 采用紫外分光光度法測定膠束制劑中阿霉素的含量。

（1）阿霉素對照品儲備液的制備：以DMSO為溶劑配制200 μg/mL的阿霉素對照品儲備液，避光備用。

（2）檢測波長的確定：分別取適量阿霉素儲備液、CMBC、LA-CMBC膠束溶液用DMSO稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度，在280～600 nm掃描其紫外吸收光譜。如圖9可見，阿霉素在481 nm處有一比較大的特征吸收峰，偶聯(lián)物CMBC和LA-CMBC在481 nm處均無吸收，說明選用LA-CMBC作為載體不會影響阿霉素的紫外吸收，因此，選用481 nm作為阿霉素定量測定的檢測波長。

圖9 阿霉素、CMBC、LA-CMBC溶液的紫外掃描圖譜Fig.9 Ultraviolet scanning atlas of doxorubicin, CMBC and LA-CMBC solutions

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：取阿霉素對照品儲備液用DMSO分別稀釋配制成質(zhì)量濃度為5、10、15、20、30、40 μg/mL的系列對照品溶液。于481 nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y＝0.019 2X＋0.004 5，R2＝0.999 4?？梢姲⒚顾卦?～40 μg/mL線性關(guān)系良好。

（4）精密度試驗：取阿霉素儲備液用DMSO稀釋成5、20、40 μg/mL的阿霉素供試液，用紫外在同天內(nèi)每個質(zhì)量濃度測量5次得到日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，得日間精密度。計算出低、中、高3種質(zhì)量濃度的阿霉素供試液的日內(nèi)RSD分別為1.83%、0.95%、0.68%；日間RSD分別為1.98%、1.52%、1.27%，均小于2.0%，滿足分析測試的要求。

（5）回收率試驗：分別配制250、1000、2000 μg/mL的阿霉素溶液各5份，各取0.2 mL，加入處方比例的LA-CMBC膠束溶液混勻后用DMSO定容至10 mL，即得質(zhì)量濃度分別為5、20、40 μg/mL的阿霉素供試液，紫外測定各吸光度值，計算阿霉素的回收率，分別為98.83%、101.19%、100.79%，說明阿霉素與LA-CMBC膠束溶液不發(fā)生吸附作用，可認(rèn)為該載體對藥物含量測定沒有影響，該方法可行。

（6）穩(wěn)定性試驗：按“2.6.1”項下方法制備阿霉素濃度為5、20、40 μg/mL的載藥膠束供試液，分別在室溫下于0、2、4、6、8、10、12、24 h測定紫外吸收。結(jié)果顯示，3種質(zhì)量濃度的供試液在24 h內(nèi)的RSD分別為1.24%、1.68%、1.52%，表明在24 h內(nèi)供試液穩(wěn)定性良好。

（7）重復(fù)性試驗：按“2.6.1”項下方法制備6份樣品溶液，分別進(jìn)行紫外測定，計算RSD值，考察重復(fù)性，結(jié)果RSD為1.49%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.3 載藥膠束中阿霉素的含量測定及結(jié)果 量取載藥膠束0.5 mL于10 mL量瓶中，加入DMSO超聲混勻并定容至刻度，按“2.6.2”項下的方法測定吸光度值，測得載藥膠束中阿霉素的包封率為（69.67±3.87）%，載藥量為（16.08±0.25）%（n＝3）（由于阿霉素是以疏水性小分子包載于自組裝膠束中，其本身溶解度很低，故不考慮極少量游離阿霉素的量）。

包封率＝m1/m2

載藥量＝m1/m總

m1為阿霉素在自組裝膠束中的量，m2為阿霉素的投料量，m總為載藥膠束的總質(zhì)量

2.6.4 DOX/LA-CMBC載藥膠束的理化性質(zhì)考察及結(jié)果 取適量載藥膠束溶液用蒸餾水稀釋后，利用馬爾文粒度儀檢測，結(jié)果見圖10。測得DOX/LACMBC載藥膠束的平均粒徑為（180.2±6.7）nm，PDI為0.140±0.003，Zeta電位為（-16.14±0.25）mV（n＝3）。

圖10 DOX/LA-CMBC的粒徑分布 (A) 和Zeta電位 (B)Fig.10 Particle size distribution (A) and Zeta potential (B)of DOX/LA-CMBC

2.6.5 不同pH值環(huán)境下載藥膠束中阿霉素、黃芩苷的體外釋放及結(jié)果 采用透析法，選取不同pH值（5.8、6.5、7.4）的PBS溶液作為釋放介質(zhì)，采用熒光分光光度法測定阿霉素在3種不同pH值PBS溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果分別為阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度（F，pH 5.8）＝163.62X＋2.475 9，R2＝0.999 5；F（pH 6.5）＝158.09X＋0.166 9，R2＝0.999 1；F（pH 7.4）＝143.06X＋1.257 1，R2＝0.999 4；結(jié)果表明阿霉素在0.02～0.80 μg/mL熒光強(qiáng)度與質(zhì)量濃度線性均良好。采用紫外法測定黃芩苷在3種PBS溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果分別為Y（pH 5.8）＝0.068 4X－0.006 1，R2＝0.999 1；Y（pH 6.5）＝0.066 8X－0.001 4，R2＝0.999 0；Y（pH 7.4）＝0.064 0X＋0.003 1，R2＝0.999 1；結(jié)果表明黃芩苷在0.1～20.0 μg/mL線性關(guān)系良好。

量取DOX/LA-CMBC溶液1 mL，置于透析袋內(nèi)，密封好后浸入含20 mL釋放介質(zhì)的錐形瓶中，在37 ℃、100 r/min轉(zhuǎn)速的條件下進(jìn)行體外釋放實驗。在預(yù)設(shè)時間點取樣1 mL，并同時補(bǔ)充等體積新鮮的釋放介質(zhì)。計算累積釋放量，分別作阿霉素、黃芩苷的體外釋放曲線（圖11）。從釋藥曲線看出，膠束中阿霉素的釋放均較為緩慢、持久，無明顯突釋現(xiàn)象。還表現(xiàn)出pH值敏感性，即在較低pH值條件下釋放較快且多，在較高pH值條件下，釋放較緩慢且較少。膠束中的黃芩苷在pH 7.4條件下只釋放了26.16%，在pH 6.5條件下釋放了38.24%，雖然比pH 7.4下釋放較快，但是釋放量依然較少，說明膠束在到達(dá)腫瘤部位前可以較好的保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。而在pH 5.8條件下不僅釋放快，釋放量還達(dá)到了68.45%，說明膠束到達(dá)腫瘤部位時，膠束體系瓦解，酰胺鍵快速水解從而釋放出黃芩苷。總之，阿霉素、黃芩苷的釋放行為一致，均表現(xiàn)為pH值敏感性。

圖11 載藥膠束中阿霉素和黃芩苷在不同pH值釋放介質(zhì)中的釋藥曲線 ( , n = 5)Fig.11 Drug release curves of doxorubicin and baicalin in drug-loading micelles in different pH release media ( ,n = 5)

2.7 體外抗腫瘤活性檢測及結(jié)果

采用MTT法檢測膠束制劑的細(xì)胞毒性。實驗中考察的黃芩苷的質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、1.00、5.00、10.00 μg/mL。簡而言之，將HepG2細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，試驗組分別加入不同質(zhì)量濃度的黃芩苷、阿霉素、CMBC、LA-CMBC和DOX/LA-CMBC溶液，對照組加入等體積培養(yǎng)液，每組5個復(fù)孔后培養(yǎng)48 h，之后棄培養(yǎng)液，每孔加10 μL MTT（5 mg/mL）和190 μL培養(yǎng)液后培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)并棄上清，每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩10 min后于570 nm處測吸光度，計算細(xì)胞生長抑制率。

細(xì)胞生長抑制率＝(A對照—A試驗)/A對照

由表3看出，純阿霉素對HepG2細(xì)胞生長抑制作用最強(qiáng)，黃芩苷、CMBC及LA-CMBC對細(xì)胞均有一定的抑制作用，并與濃度成依賴性。在實驗濃度下，黃芩苷的抑制率從5%升至35%，CMBC抑制率從10%升至46%，LA-CMBC抑制率從14%升至51%，表明與黃芩苷相比，CMBC與LA-CMBC的抑制率均高于黃芩苷（P＜0.05），表明黃芩苷作為疏水端包裹于膠束中能顯著提高其抗腫瘤效果。且LA-CMBC與CMBC相比，差異具有顯著性（P＜0.05），可認(rèn)為LA-CMBC比CMBC有較強(qiáng)抑制作用，一定程度上表明了乳糖酸的靶向作用。在膠束質(zhì)量濃度為1～10 μg/mL內(nèi)，DOX/LA-CMBC的抑制作用最強(qiáng)（P＜0.01），說明以LA-CMBC為載體共同遞送阿霉素和黃芩苷可行。

表3 黃芩苷、阿霉素、CMBC、LA-CMBC和DOX/LA-CMBC對HepG2細(xì)胞的生長抑制率 ( , n = 3)Table 3 Growth inhibition rate of baicalin, doxorubicin, CMBC, LA-CMBC and DOX/LA-CMBC on HepG2 cells ( ,n = 3)

表3 黃芩苷、阿霉素、CMBC、LA-CMBC和DOX/LA-CMBC對HepG2細(xì)胞的生長抑制率 ( , n = 3)Table 3 Growth inhibition rate of baicalin, doxorubicin, CMBC, LA-CMBC and DOX/LA-CMBC on HepG2 cells ( ,n = 3)

與黃芩苷組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與CMBC組比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs baicalin group; #P ＜ 0.05 vs CMBC group

樣品 細(xì)胞生長抑制率/%0.25 μg·mL-1 0.50 μg·mL-1 1.00 μg·mL-1 5.00 μg·mL-1 10.00 μg·mL-1黃芩苷 5.1±1.2 9.0±0.5 15.2±1.4 28.2±0.7 35.4±1.0阿霉素 35.0±2.4 53.4±1.5 62.3±2.0 73.1±1.6 79.2±1.2 CMBC 10.4±2.2 12.1±1.7* 20.6±2.5* 33.3±1.3* 46.0±1.7*LA-CMBC 14.2±1.6 15.1±1.9*# 25.6±2.4*# 40.5±1.0*# 51.3±1.5*#DOX/LA-CMBC 28.3±2.1*# 31.1±1.6*# 47.6±1.2**# 63.5±1.8**# 70.2±0.9**#

3 討論

本研究在OCMC偶聯(lián)黃芩苷形成的前藥基礎(chǔ)上進(jìn)行靶向修飾，獲得LA-CMBC并以其為載體制備載藥膠束，實現(xiàn)黃芩苷與阿霉素的共同遞送，所制備的膠束具有較好的制劑學(xué)性質(zhì)。圖12為DOX/LA-CMBC膠束形成示意圖。OCMC骨架構(gòu)成親水性外殼，增加了膠束的血液循環(huán)時間，在膠束表面形成水化層而阻止血漿調(diào)理素等蛋白吸附在膠束表面，避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬[2]。疏水性藥物黃芩苷締合為疏水內(nèi)核同時作為一種藥物，與阿霉素共同遞送來發(fā)揮協(xié)同抗癌作用。

圖12 DOX/LA-CMBC載藥膠束形成示意圖Fig.12 Schematic diagram of DOX/LA-CMBC drug-carrying micelle formation

在考察膠束體外釋放時發(fā)現(xiàn)當(dāng)釋放介質(zhì)pH值為5.8時，膠束體系出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，但全程未見有明顯的沉淀，推測在酸性條件下膠束體系穩(wěn)定性下降，從而使體系趨于瓦解，但并未達(dá)到徹底裂解、聚集并沉淀的程度，這與文獻(xiàn)報道一致[13]。

細(xì)胞毒性實驗表明，純阿霉素對HepG2細(xì)胞生長抑制作用最強(qiáng)，這是因為純阿霉素溶液通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，而膠束通過靶向作用及實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）到達(dá)腫瘤環(huán)境并存在緩慢的胞內(nèi)釋藥行為，所以使進(jìn)入并富集于細(xì)胞的藥量少于純阿霉素，但是阿霉素選擇性差，毒副作用大。CMBC和LA-CMBC的抑制作用比DOX/ LACMBC的弱，這是由于后者除了有乳糖酸介導(dǎo)的靶向作用還會通過體系瓦解、酰胺鍵水解釋放DOX、黃芩苷2種藥物，且據(jù)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[1,24]推測2藥物可能具有協(xié)同的抗肝癌作用。具體機(jī)制如下：褚冬青等[25]發(fā)現(xiàn)將黃芩苷與DOX聯(lián)用可以誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞凋亡，并且協(xié)同增效機(jī)制可以下調(diào)Bcl-2、磷酸化粘著斑激酶（phosphorylated focal adhesion kinase，p-FAK）及磷酸化酪氨酸蛋白激酶（phosphorylated tyrosine protein kinase，p-Src）蛋白表達(dá)；郁潔雯等[26]將黃芩苷與阿霉素聯(lián)用抑制腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，其效果優(yōu)于單個藥物治療，可見二者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗腫瘤作用。腫瘤的發(fā)生從來都不是一種基因異常造成的，聯(lián)合給藥才可增強(qiáng)藥效。黃芩苷可以阻滯HepG2肝癌細(xì)胞在S期，通過促進(jìn)人肝癌細(xì)胞的E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cd）表達(dá)，抑制整合素-β1（integrin-β1）表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）mRNA和蛋白的表達(dá)以及抑制STAT3蛋白的磷酸化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[27]。阿霉素可通過下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)以及誘導(dǎo)Wnt通路抑制劑的表達(dá)來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[28]?？梢婞S芩苷和阿霉素可以通過不同的作用機(jī)制誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。故本研究推測，當(dāng)膠束通過主動靶向作用及EPR效應(yīng)到達(dá)腫瘤環(huán)境釋放黃芩苷、阿霉素時，兩者可以發(fā)生協(xié)同作用。本研究將在動物水平上繼續(xù)考察兩者的協(xié)同效應(yīng)，為中草藥與化療藥物的協(xié)同抗肝癌研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突