輔料砂仁、陳皮對熟地黃炮制前后化學(xué)成分的影響研究

陳青垚，王小平，雷 星，高亞珍，徐 杰，王梁鳳，王 芳*，楊 明*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004

2.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000

熟地黃Rehmanniae Radix Praeparata（RRP）為玄參科地黃屬植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的炮制加工品。地黃Rehmanniae Radix（RR）炮制成熟地黃，其性味由甘、寒轉(zhuǎn)為甘、微溫，功能與主治由清熱涼血、養(yǎng)陰生津轉(zhuǎn)為補血滋陰、益精填髓[1]?！端幤坊x》：“因肝苦急，用甘緩之，兼主溫膽，能益心血，更補腎水。凡內(nèi)傷不足，苦志勞神，憂患傷血，縱欲耗精，調(diào)經(jīng)胎產(chǎn)，皆宜用此”。因熟地黃味厚，質(zhì)黏膩，而易礙胃助濕，《顧松園醫(yī)鏡·本草必用》：“熟者性滯，若痰多氣郁之人，能窒礙胸膈”，現(xiàn)代研究亦表明，熟地黃易引起滋膩礙胃現(xiàn)象[2]。砂仁陳皮制地黃是江西建昌幫特色炮制品種，經(jīng)砂仁Amomi Fructus（AF）、陳皮Citri Reticulatae Pericarpium（CRP）、黃酒制后，取砂仁、陳皮辛溫香竄之氣，疏地黃之滯，糾熟地滋膩礙脾之弊[3]。目前，輔料砂仁、陳皮對地黃內(nèi)含化學(xué)成分的具體影響尚無研究報道。熟地黃主要的藥理作用是調(diào)節(jié)免疫、影響血液系統(tǒng)功能，其藥效活性物質(zhì)主要包括環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類及糖類等成分[4]。本實驗采用HPLC法建立砂仁陳皮制熟地黃及不同缺輔料熟地黃炮制品圖譜，運用化學(xué)模式識別手段分析不同炮制品之間的差異情況，并對其炮制前后主要藥效活性物質(zhì)環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類及糖類成分進行含量測定，以期明確輔料砂仁、陳皮對熟地黃內(nèi)含化學(xué)成分的具體影響，為闡明砂仁陳皮制熟地黃的炮制機制提供依據(jù)。

1 材料

LC-20ADXR型高效液相色譜儀、ELSD-LT II低溫型蒸發(fā)光散射檢測器，日本島津公司；XSE205DR梅特勒電子天平，德國Mettler-Toledo公司；D24UV純水超純水一體化機，默克密理博公司；ZKF040型真空干燥箱，上海實驗儀器廠有限公司。

生地黃（產(chǎn)地河南，批號191115）、砂仁（產(chǎn)地云南，批號180627）、陳皮（產(chǎn)地浙江，批號200801-2），均購自安徽益生源中藥飲片科技有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)葛菲教授鑒定，分別為玄參科地黃屬植物地黃Rehmannia glutinosa(Gaetn.) Libosch.ex Fisch.et Mey.的干燥塊根、姜科豆蔻屬植物陽春砂Amomum villosumLour.的干燥成熟果實、蕓香科柑橘屬植物橘Citrus reticulataBlanco的干燥成熟果皮。

對照品梓醇（批號MUST-14122411）、益母草苷（批號MUST-20052601）、地黃苷D（批號MUST-20101311）、5-羥甲基糠醛（批號MUST-20051202）、毛蕊花糖苷（批號MUST-13122711）、異類葉升麻苷（批號MUST-20103104）、橙皮苷（批號MUST-20031701）、蔗糖（批號MUST-13122601），葡萄糖（批號MUST-18032905）、D-果糖（批號MUST-13072803）、毛蕊花糖（批號MUST-20112705）購自成都曼思特生物科技有限公司；對照品水蘇糖（批號PS020341）購自成都普思生物科技有限公司；對照品蜜二糖（批號505A023）購自北京索萊寶科技有限公司；對照品棉子糖（批號TA0423CA14）、甘露三糖（批號L29M6Y1）購自上海月旭科技有限公司；以上對照品質(zhì)量分數(shù)均≥98%；乙腈為色譜級，美國Thermo Fisher Scientific公司；所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 地黃炮制品的制備

參照《建昌幫中藥炮制技術(shù)》[5]，分別制備砂仁陳皮制熟地黃、砂仁陳皮制熟地黃（缺陳皮）、砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁）、砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁、陳皮）炮制品各10份，粉碎過三號篩，備用。

2.2 地黃樣品特征圖譜的建立

2.2.1 參照峰選擇及混合對照品溶液配制 異類葉升麻苷是生、熟地黃中的主要有效成分之一，鑒于該色譜峰峰面積較穩(wěn)定，故選擇異類葉升麻苷作為參照峰；精密稱取5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、異類葉升麻苷、橙皮苷對照品適量，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為5-羥甲基糠醛724.50 μg/mL、毛蕊花糖苷12.66 μg/mL、異類葉升麻苷18.43 μg/mL、橙皮苷29.46 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取不同熟地黃炮制品粉末2 g置于圓底燒瓶，精密量取50 mL甲醇，稱定質(zhì)量，加熱1 h，冷卻，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，蒸干，用甲醇定容至2 mL量瓶，臨用前用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得[6]。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Inert Sustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，3%～4%乙腈；15～45 min，4%～12%乙腈；45～60 min，12%～15%乙腈；60～80 min，15%～16%乙腈；80～120 min，16%～28%乙腈；進樣量20 μL；柱溫40 ℃；體積流量1 mL/min；檢測波長283 nm。

2.2.4 精密度試驗 精密稱取砂仁陳皮制熟地黃粉末（S31），依“2.2.2”項方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，以參考峰的保留時間和峰面積為參照，計算共有峰的相對保留時間、相對峰面積RSD均小于1.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取砂仁陳皮制熟地黃粉末（S31），分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.3”項色譜條件進樣，以參考峰的保留時間和峰面積為參照，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一份砂仁陳皮制熟地黃粉末（S31），按“2.2.2”項方法平行制備6個供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進樣分析，以參考峰的保留時間和峰面積為參照，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1.7%，表明色譜條件重復(fù)性良好。

2.2.7 地黃樣品測定 取5種地黃樣品各10份，在“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣，圖譜結(jié)果見圖1，并采用《中藥指紋圖譜相似度評價評價系統(tǒng)》（2012版）對所記錄的圖譜進行分析，分別各自生成了5種地黃樣品對照圖譜，識別了生地黃24個共有峰，砂仁陳皮制熟地黃23個共有峰、砂仁陳皮制熟地黃（缺陳皮）19個共有峰、砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁）22個共有峰、砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁、陳皮）24個共有峰，并且通過與混合對照品圖譜（圖2）比對指認其中的4個，分別是異類升麻苷、毛蕊花糖苷、異類葉升麻苷、橙皮苷，其保留時間分別為14.083、82.577、91.189、95.760 min。

圖1 地黃樣品圖譜結(jié)果Fig.1 Atlas results of RR samples

圖2 地黃不同炮制品對照圖譜和混合對照品圖譜Fig.2 Comparative atlas of different RR processed and mixed reference substances

2.3 化學(xué)模式識別分析

2.3.1 系統(tǒng)聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA） 以“2.2.7”項下50個地黃樣品全譜峰面積為變量，采用SPSS 21.0分析軟件，以組間平均數(shù)聯(lián)接法及Pearson相關(guān)性分析方法進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，50個地黃樣品可自然聚為3大類，生地黃為第1類（S41～S50），砂仁陳皮制熟地黃為第2類（S31～S40），砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁、陳皮）、砂仁陳皮制熟地黃（缺陳皮）、砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁）聚為第3類（S1～S30）。

圖3 系統(tǒng)聚類分析圖Fig.3 System cluster analysis diagram

2.3.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 運用SIMCA 14.1軟件，以50個地黃樣品（S1～S50）圖譜的峰面積值作為變量，觀察炮制品的聚集情況，見圖4。PCA得分圖結(jié)果與上述聚類分析結(jié)果相一致，表明不同炮制品在主成分空間的分布上有特定區(qū)域，進一步確定炮制品可明顯歸為3類。

圖4 地黃不同炮制品PCA得分圖Fig.4 PCA score maps of different processed products of RR

2.3.3 差異成分分析 為了進一步篩選引起砂仁陳皮制熟地黃炮制品質(zhì)量特征差異的標志性成分，利用SIMCA 14.1軟件對50個地黃樣品（S1～S50）圖譜的原始數(shù)據(jù)進行正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），考慮到數(shù)據(jù)較多，以變量VIP＞1.4作為篩選標準，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，有15個成分符合篩選條件，即這些成分是造成不同地黃炮制品質(zhì)量差異的主要標志性物質(zhì)，其中12、94、97號峰分別為5-羥甲基糠醛、異類葉升麻苷、橙皮苷。

圖5 50個地黃樣品全譜峰OPLS-DA模型VIP圖Fig.5 VIP diagram of full-peak OPLS-DA model of 50 samples of RR

2.4 非糖類成分含量測定

2.4.1 非糖類成分對照品溶液的制備 取梓醇、益母草苷、地黃苷D、5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、橙皮苷、異類葉升麻苷適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為梓醇0.297 mg/mL、益母草苷0.219 mg/mL、地黃苷D 0.161 mg/mL、5-羥甲基糠醛0.046 mg/mL、毛蕊花糖苷0.077 5 mg/mL、橙皮苷0.071 mg/mL、異類葉升麻苷0.044 mg/mL的混合對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 取炮制品粉末0.5 g置于帶塞錐形瓶中，精密量取50 mL甲醇，稱定質(zhì)量，置室溫下冷浸12 h后超聲1.5 h（功率250 W，頻率40 kHz），冷卻至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘渣用15%甲醇溶解，定容至5 mL量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得[7]。

2.4.3 色譜條件 色譜柱為Inert Sustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水，梯度洗脫：0～20 min，3%乙腈；20～40 min，3%～20%乙腈；40～60 min，20%～23%乙腈；進樣量10 μL；柱溫40 ℃；體積流量1 mL/min；梓醇、益母草苷、地黃苷D檢測波長203 nm，5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、橙皮苷檢測波長285 nm，異類葉升麻苷檢測波長334 nm。

2.4.4 線性關(guān)系考察 依次量取“2.4.1”項下混合對照品溶液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 mL于5 mL量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按“2.4.3”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，進行線性回歸，得到梓醇、益母草苷、地黃苷D、5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、橙皮苷、異類葉升麻苷的回歸方程及其線性范圍分別為梓醇Y＝13 582X＋340 912，r＝0.999 3，線性范圍5.94～297.20 μg/mL；地黃苷DY＝2619X＋46 826，r＝0.999 7，線性范圍4.40～220.00 μg/mL；益母草苷Y＝2156X－456.65，r＝0.999 0，線性范圍3.22～161.00 μg/mL；5-羥基甲糠醛Y＝196 591X－168 236，r＝0.999 9，線性范圍0.92～46.00 μg/mL；毛蕊花糖苷Y＝796 324X－2 856.2，r＝0.999 9，線性范圍1.56～78.00 μg/mL；橙皮苷Y＝1 418 395X－7 438.1，r＝0.999 8，線性范圍1.42～71.00 μg/mL；異類葉升麻苷Y＝582 792X＋1 289.8，r＝0.999 9，線性范圍0.88～44.00 μg/mL。

2.4.5 精密度試驗 取“2.4.1”項下對照品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算梓醇、益母草苷、地黃苷D、5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、橙皮苷、異類葉升麻苷峰面積的RSD分別為0.41%、0.81%、0.76%、0.61%、0.86%、1.01%、0.79%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取砂仁陳皮制熟地黃粉末（S31），按“2.3.2”項方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.4.3”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算益母草苷、地黃苷D、5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、橙皮苷、異類葉升麻苷峰面積RSD分別為1.66%、1.31%、0.67%、1.73%、2.00%、0.75%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一份砂仁陳皮制熟地黃粉末（S31）6份，按“2.4.2”項下平行制備供試品溶液，依“2.4.3”項色譜條件下進樣，測定峰面積，計算益母草苷、地黃苷D、5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、橙皮苷、異類葉升麻苷平均質(zhì)量分數(shù)分別為6.179、1.079、3.982、0.265、2.896、1.617 mg/g，RSD分別為1.21%、0.86%、0.89%、1.36%、1.20%、0.99%，表明色譜條件重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 精密稱取已測定含量的砂仁陳皮制熟地黃粉末（S31）6份，分別加入“2.4.1”項下對照品溶液2.5 mL，按“2.4.2”項下制備供試品溶液，依“2.4.3”項色譜條件進樣，測定各成分含量，計算梓醇、益母草苷、地黃苷D、5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、橙皮苷、異類葉升麻苷的平均加樣回收率分別98.9%、99.4%、98.3%、99.7%、98.5%、99.9%、101.6%，RSD分別為0.91%、1.21%、0.86%、0.97%、1.04%、1.15%、0.99%。

2.4.9 樣品含量測定結(jié)果 按“2.4.2”項方法制備供試品溶液，平行制備3份，依“2.4.3”項下色譜條件測定，結(jié)果見圖6，記錄各炮制品中測定成分的峰面積，含量計算結(jié)果見表1。

表1 地黃不同炮制品中非糖類成分的質(zhì)量分數(shù) ( , n = 3)Table 1 Mass fraction of non-sugar components in different processed products of RR ( , n = 3)

表1 地黃不同炮制品中非糖類成分的質(zhì)量分數(shù) ( , n = 3)Table 1 Mass fraction of non-sugar components in different processed products of RR ( , n = 3)

“-”表明響應(yīng)值小無法積分，下表同“-” indicates that the response value is too small to integrate, same as following table

樣品 質(zhì)量分數(shù)/(mg·g-1)梓醇 地黃苷D 益母草苷 5-羥甲基糠醛 毛蕊花糖苷 橙皮苷 異類葉升麻苷生地黃 5.251±0.019 3.146±0.015 2.820±0.011 0.027±0.001 0.278±0.002 0 0.064±0.002砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁、陳皮） - 1.289±0.009 0.312±0.005 0.754±0.008 0.088±0.001 0 0.315±0.006砂仁陳皮制熟地黃（缺陳皮） - 1.109±0.008 0.213±0.002 0.570±0.003 0.059±0.001 0 0.194±0.002砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁） - 1.033±0.010 0.208±0.002 0.757±0.006 0.059±0.001 0.908±0.008 0.215±0.003砂仁陳皮制熟地黃 - 1.234±0.009 0.218±0.002 0.795±0.007 0.053±0.001 0.581±0.004 0.325±0.003

圖6 地黃不同炮制品非糖類成分 (A) 及其混合對照品 (B) HPLC圖Fig.6 HPLC map of non-sugar components of different processed products of RR (A) and its mixed reference substance (B)

2.5 糖類成分含量測定

2.5.1 糖類成分對照品溶液的制備 取D-果糖、葡萄糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、甘露三糖、水蘇糖、毛蕊花糖對照品適量，精密稱定，水溶解制成質(zhì)量濃度分別為D-果糖6.888 mg/mL、葡萄糖3.572 mg/mL、蔗糖3.704 mg/mL、蜜二糖9.638 mg/mL、棉子糖4.384 mg/mL、甘露三糖1.334 mg/mL、水蘇糖1.299 mg/mL、毛蕊花糖2.012 mg/mL的混合對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 分別取“2.1”項下5種炮制品粉末約1 g置于具塞錐形瓶中，精密稱取60%甲醇溶液50 mL，超聲45 min，濾過，吸取續(xù)濾液2 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.5.3 色譜條件 Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱；流動相為乙腈-水溶液，梯度洗脫：0～10 min，75%乙腈；10～20 min，75%～65%乙腈；20～45 min，65%乙腈；進樣量5 μL；柱溫40 ℃；體積流量1 mL/min；ELSD參數(shù)：霧化溫度40 ℃，氮氣壓力為350 Pa。

2.5.4 線性關(guān)系考察 分別吸取“2.5.1”項下混合對照品溶液0.25、1.00、2.00、4.00、5.00 mL置于5 mL量瓶中，定容，得系列混合對照品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件測定，以糖類成分峰面積的自然對數(shù)為縱坐標（Y），糖類成分的質(zhì)量的自然對數(shù)為橫坐標（X）作圖，進行線性回歸方程計算，計算D-果糖、葡萄糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、甘露三糖、水蘇糖、毛蕊花糖回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r），結(jié)果分別為D-果糖Y＝1.138X＋4.660，r＝0.999 7，線性范圍1.72～34.44 μg；葡萄糖Y＝1.282X＋3.872，r＝0.999 4，線性范圍0.89～17.86 μg；蔗糖Y＝2.771X＋3.047，r＝0.999 2，線性范圍0.93～18.52 μg；蜜二糖Y＝2.353X＋2.215，r＝0.999 3，線性范圍2.41～48.19 μg；棉子糖Y＝2.078X＋3.658，r＝0.999 7，線性范圍1.10～21.92 μg；甘露三糖Y＝1.727X＋4.153，r＝0.999 5，線性范圍0.33～6.67 μg；水蘇糖Y＝1.267X＋4.102，r＝0.999 9，線性范圍3.25～65.00 μg；毛蕊花糖Y＝1.332X＋4.571，r＝0.999 1，線性范圍0.50～10.06 μg。

2.5.5 精密度試驗 取“2.5.1”項下對照品溶液，依“2.4.3”項色譜條件連續(xù)進樣6次，測得D-果糖、葡萄糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、甘露三糖、水蘇糖、毛蕊花糖峰面積RSD分別為0.78%、1.01%、0.63%、0.44%、0.69%、0.93%、1.04%、0.77%，表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取生地黃粉末（S41），按“2.5.2”項下制備供試品溶液，在制備后0、2、4、8、12、24 h依“2.5.3”項色譜條件進樣，測得D-果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖峰面積RSD分別為1.89%、1.24%、0.76%、0.86%、0.63%、0.93%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗 精密稱量同一份生地黃粉末（S41），平行制備6份，按“2.5.3”項下色譜方法進樣，測得D-果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖平均質(zhì)量分數(shù)分別為19.022、27.256、88.954、94.652、248.507、13.040 mg/g，RSD分別為1.01%、0.89%、0.95%、0.89%、1.43%、0.91%，表明重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗 精密稱取已測定含量的生地黃（S41）6份，分別加入“2.5.1”項下糖類對照品溶液3 mL，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，依“2.5.3”項色譜條件進樣，測定含量，計算D-果糖、葡萄糖、蔗糖、蜜二糖、棉子糖、甘露三糖、水蘇糖、毛蕊花糖的平均加樣回收率分別為98.8%、99.1%、97.0 %、100.5%、97.4%、99.4%、98.6%、101.5%，RSD值分別為1.24%、0.98%、1.36%、1.07%、0.95%、1.79%、0.99%、1.56%。

2.5.9 樣品含量測定結(jié)果 糖類對照品溶液與供試品溶液分別按“2.5.3”項下色譜條件測定，結(jié)果見圖7和表2。

表2 地黃不同炮制品中糖類成分的質(zhì)量分數(shù) ( , n = 3)Table 2 Mass fraction of sugars in different processed products of RR ( , n = 3)

表2 地黃不同炮制品中糖類成分的質(zhì)量分數(shù) ( , n = 3)Table 2 Mass fraction of sugars in different processed products of RR ( , n = 3)

樣品質(zhì)量分數(shù)/(mg·g-1)D-果糖 葡萄糖 蔗糖 蜜二糖 棉子糖 甘露三糖 水蘇糖 毛蕊花糖生地黃 18.632±0.076 27.445±0.048 89.047±0.105 - 94.533±0.128 - 248.469±0.526 13.577±0.017砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁、陳皮） 127.543±0.187 76.141±0.081 - 82.561±0.119 - 40.752±0.048 - -砂仁陳皮制熟地黃（缺陳皮） 164.461±0.256 104.094±0.122 - 78.740±0.111 - 43.000±0.082 - -砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁） 177.172±0.401 119.037±0.309 - 80.448±0.088 - 51.096±0.089 - -砂仁陳皮制熟地黃 174.405±0.296 119.854±0.185 - 79.488±0.097 - 57.196±0.079 - -

圖7 地黃不同炮制品糖類成分 (A) 和糖類對照品 (B) HPLC圖譜Fig.7 HPLC map of sugars composition in different processed products of RR (A) and sugars reference substances (B)

3 討論

3.1 地黃樣品特征圖譜分析

本研究采用HPLC色譜建立了生地黃、砂仁陳皮制熟地黃及不同缺輔料熟地黃炮制品圖譜，經(jīng)分析，5種炮制品可明顯歸為3類，即生地黃、砂仁陳皮制熟地黃與砂仁陳皮制熟地黃不同缺輔料熟地黃炮制品，可知生、熟地黃之間以及佐以砂仁、陳皮都使地黃在成分空間存在差異[8-9]。差異成分篩選結(jié)果顯示，12（5-羥甲基糠醛）、94（異類葉升麻苷）、97（橙皮苷）號峰是引起地黃樣品質(zhì)量特征差異的主要成分，炮制后5-羥甲基糠醛大幅度產(chǎn)生，使熟地黃向溫性轉(zhuǎn)變[10]，異類葉升麻苷是補腎的重要成分[10-11]，橙皮苷是砂仁陳皮制熟地黃新增成分[12]，現(xiàn)代研究表明橙皮苷具有促進胃腸蠕動的功效[13]，預(yù)測砂仁、陳皮共炮制使砂仁陳皮制熟地黃更好地發(fā)揮益精填髓的功效，糾熟地滋膩礙脾之弊。剩余12個差異成分有待進一步研究。

3.2 地黃炮制前后非糖類成分的變化

炮制工藝與質(zhì)量評價中，多注重成分炮制前后變化趨勢[14-15]。上述實驗結(jié)果表明，生地黃炮制后，苷類含量總體呈減少趨勢，苷類成分受熱酯鍵斷裂，梓醇、益母草苷、地黃苷D、毛蕊花糖苷可分解出葡萄糖和相應(yīng)苷元，異類葉升麻苷可分解出甘露吡喃糖、葡萄糖和相應(yīng)苷元[10]，炮制后增加的葡萄糖、果糖與氨基酸易發(fā)生美拉德反應(yīng)，使5-羥甲基糠醛成分含量升高，故炮制后地黃烏黑如漆[16]；砂仁陳皮制熟地黃中地黃苷D、異類葉升麻苷、益母草苷含量均高于砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁）、砂仁陳皮制熟地黃（缺陳皮），推測同時佐以砂仁、陳皮在一定程度緩解了地黃苷D、異類葉升麻苷、益母草苷的分解。

3.3 地黃炮制前后糖類成分的變化

糖類成分含測結(jié)果顯示，炮制后糖類成分呈寡糖減少，單糖增加的趨勢，且砂仁陳皮制熟地黃中D-果糖、葡萄糖、甘露三糖含量相較于砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁、缺陳皮）分別增加了29.24%、57.14%、44.65%，可知同時佐以砂仁、陳皮能有效促進低聚糖分解成單糖、增加新增成分甘露三糖的穩(wěn)定性，實驗數(shù)據(jù)顯示砂仁陳皮制熟地黃（缺砂仁）中糖類成分的變化也尤為突出。炮制過程中，水蘇糖主要分解為甘露三糖和D-果糖[17]，棉子糖可分解為蜜二糖和果糖或半乳糖和蔗糖，部分甘露三糖、蜜二糖可分解成半乳糖和葡萄糖[18]，蔗糖分解成葡萄糖和D-果糖[19]，由于人體缺乏消化酶α-D-半乳苷酶，而砂仁、陳皮的加入可使D-果糖、葡萄糖含量均升高，易于消化，改善了熟地黃滋膩之性，而單糖增加的變化趨勢是否改變腸內(nèi)固有的菌群代謝也值得后期深入研究[20]；現(xiàn)代藥理研究表明果糖、葡萄糖具有為機體直接供給熱能、補充體液及營養(yǎng)全身的補益功效[21]；蜜二糖、甘露三糖是生地黃炮制后新增成分，研究發(fā)現(xiàn)甘露三糖對體外小鼠骨髓細胞的增殖作用與對照組有顯著性差異，表明甘露三糖是熟地增強免疫、造血、降血糖等活性的重要成分[22]。李時珍提出“蓋地黃性泥得砂之香而竄，合和五臟沖和之氣歸縮丹田故也”，相較于清蒸地黃，炮制過程加入砂仁可提高血清胃泌素、血漿胃動素的含量，降低胃內(nèi)容物殘留率，有效消除大鼠滋膩礙胃的現(xiàn)象[2]，研究表明，陳皮能促進胃腸動力、胃排空、胃腸蠕動作用，與傳統(tǒng)功效“理氣寬中”相一致[23]。地黃同砂仁、陳皮共炮制時，香燥之性滲透至地黃內(nèi)，緩解熟地滋膩之性[24]；上述研究發(fā)現(xiàn)輔料砂仁、陳皮是改變砂仁陳皮制熟地黃成分種類、成分含量的重要因素，為闡述砂仁陳皮制熟地黃的炮制機理奠定基礎(chǔ)，后期將進一步研究砂仁、陳皮引起熟地黃成分變化對藥效的影響[25]。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突