基于適體傳感器的Cu2+檢測(cè)研究

黃小凡

（合肥工業(yè)大學(xué),安徽合肥,230009）

0 引言

近年來(lái)，隨著工業(yè)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，各種工業(yè)廢水直接排出，導(dǎo)致土壤和水體中的銅含量極具增加[1]，銅可以在土壤和水體中逐漸積累并且很難消失，近年來(lái)我國(guó)土壤中的銅含量嚴(yán)重超標(biāo)，已經(jīng)達(dá)到土壤背景值的幾十倍，許多冶煉廠附近的銅含量高達(dá)809.30～1395.54mg/kg，嚴(yán)重抑制了植物的生長(zhǎng)。另外Cu2+雖然在人類的各種生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，但是，過(guò)量的銅會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生毒性，即使短時(shí)間暴露在高濃度的銅中[2]，也可能會(huì)引起胃腸道疾病，長(zhǎng)期接觸會(huì)造成肝臟或腎臟損害[3],為了維持健康的身體，根據(jù)國(guó)家研究委員會(huì)（NRC），嬰兒每天消耗0.4-0.6μmg 的銅，兒童每天消耗1.5-2.5μmg 的銅，成人每天消耗1.5-3.0μmg 的銅,因此，從環(huán)境和人類健康監(jiān)測(cè)的角度出發(fā)，開發(fā)一種方便可靠的Cu2+檢測(cè)方法具有重要意義。

多種分析檢測(cè)技術(shù)已廣泛用于測(cè)定Cu2+，包括原子吸收光譜法，電感耦合等離子體質(zhì)譜法，紫外可見(jiàn)光譜法，但是他們需要笨重的設(shè)備，復(fù)雜的預(yù)處理過(guò)程，檢測(cè)能力差等一系列缺點(diǎn)，本文提出的適體傳感器檢測(cè)技術(shù)因其成本低，響應(yīng)速度快，檢出限低（LOD），出色的靈敏度和選擇性而備受廣泛關(guān)注。

1 傳感器的識(shí)別機(jī)制

1.1 特異性識(shí)別Cu2+

本文使用SSA-CuII 適體作為識(shí)別Cu2+的特異性探針[4],其適體篩選過(guò)程為：適體文庫(kù)中每一條適體的中心是恒定域，兩側(cè)是兩個(gè)隨機(jī)域，金屬離子與隨機(jī)域結(jié)合，導(dǎo)致紅色分子從中間恒定域脫離，紅色分子的脫離導(dǎo)致紅色熒光減少，可以通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選法（FACS）檢測(cè)到，將紅色固定分子脫離以后的適體篩選出來(lái)，經(jīng)過(guò)克隆和測(cè)序即可得到特異性SSA-CuII 適體。

1.2 傳感器檢測(cè)過(guò)程中電容的變化

當(dāng)電極浸入電解液時(shí)，電極/流體系統(tǒng)可以簡(jiǎn)化為由電容元件和電阻元件構(gòu)成的等效電路網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，當(dāng)一個(gè)頻率范圍低于百千赫茲的交流信號(hào)施加在電極兩端時(shí)，此時(shí)的等效電路網(wǎng)絡(luò)可以簡(jiǎn)化為兩個(gè)界面電容Cint和一個(gè)電解質(zhì)電阻Rf的串聯(lián)[5],使用阻抗分析儀測(cè)量的Cint值即為傳感器對(duì)Cu2+響應(yīng)直接轉(zhuǎn)換的電學(xué)信號(hào)，因此，測(cè)量電容值的變化可以用來(lái)表示溶液中Cu2+的濃度。

對(duì)于功能之前的裸電極，其界面電容（Cint）主要來(lái)自于傳感表面形成的雙電層（EDL），當(dāng)電極浸沒(méi)在溶液中時(shí)，電極表面將獲得表面電荷，為了保持電荷中性，在電極/液體邊界的一個(gè)薄層中誘導(dǎo)反離子來(lái)對(duì)抗電極表面的電荷，這通常被稱為雙電層（EDL），將反離子層作為一個(gè)平板，電極表面作為另一個(gè)平板，可以將EDL 模擬為界面電容器，當(dāng)目標(biāo)分子被收集到電極表面時(shí)，EDL 的厚度會(huì)增加，從而降低傳感器的界面電容。

如圖1 所示的識(shí)別過(guò)程示意圖，在電極功能化以后，探針-目標(biāo)物結(jié)合過(guò)程中界面層厚度的增加會(huì)導(dǎo)致界面電容（Cint）的減小，這是由于使用ACEK 信號(hào)并且以電學(xué)方式檢測(cè)到，在這項(xiàng)工作中，對(duì)Cint進(jìn)行測(cè)量，并將其用作適體-目標(biāo)物結(jié)合的指標(biāo)，如圖1（a）所示，在適體與Cu2+結(jié)合之前，初始界面電容Cint可以表示為：

圖1 傳感器表面的電容變化過(guò)程

其中A 為界面電容的有效表面積，ε EDL和εapt分別為溶液和適體的介電常數(shù)，D EDL和Dapt分別為EDL 層和適體層的厚度，檢測(cè)過(guò)程中Cu2+受到ACET 流的推動(dòng)與電極表面固定的適體相互結(jié)合使介電層變厚，此時(shí)界面電容Cfint可表示為：

其中εCu為Cu2+的介電常數(shù)，D Cu為Cu2+層的厚度，在這項(xiàng)研究中，該電容的變化?C作為一個(gè)非常敏感的參數(shù)，被用來(lái)作為指標(biāo)來(lái)反映靶標(biāo)的結(jié)合程度，這與不同的Cu2+水平直接相關(guān)，為了減小初始電容不一致造成的檢測(cè)誤差，引入歸一化電容?C/Cfint作為標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果，其表達(dá)式為：

?C是1 分鐘內(nèi)的電容變化，?C/Cint可以直接指示電極表面上結(jié)合Cu2+的水平，表明界面電容是定量指標(biāo)，在后面的部分中，每分鐘的?C/Cint表示為dC/dt。

1.3 Cu2+的富集機(jī)制

為了實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，將分析物集中到傳感器上的結(jié)合位點(diǎn)是減少響應(yīng)時(shí)間和提高靈敏度的必要技術(shù)，在基于傳感器檢測(cè)分析中，盡管從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看達(dá)到了預(yù)期，但絕大多數(shù)由于待測(cè)分析物向受體擴(kuò)散效率低，可能導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)天，這樣就無(wú)法滿足實(shí)時(shí)檢測(cè)的要求，為了克服這一局限性，加快檢測(cè)過(guò)程，本文利用交流動(dòng)電效應(yīng)（ACEK）作為一種有效的Cu2+富集方法，ACEK 效應(yīng)主要是用于研究液體環(huán)境中電解質(zhì)和極化粒子在交流電場(chǎng)作用下的行為，在交流電場(chǎng)的影響下，由于流體中的感應(yīng)電荷會(huì)隨外電場(chǎng)改變其極性，即可產(chǎn)生非振蕩的粒子或流體運(yùn)動(dòng)，一般來(lái)說(shuō)，誘導(dǎo)納米顆粒做定向移動(dòng)的ACEK 效應(yīng)主要有三種:介電泳（DEP）、交流電滲（ACEO）和交流電熱（ACET），三者的共同作用均是加速待測(cè)分析物與識(shí)別探針進(jìn)行結(jié)合，降低傳感器響應(yīng)時(shí)間。

2 材料與方法

2.1 試劑準(zhǔn)備

使用稀釋以后的磷酸鹽緩沖液把制備好的適體稀釋到一定的濃度，以備后續(xù)功能化電極使用，6-巰基-1-己醇（6-MCH）作為封閉劑，使用PBS 緩沖液進(jìn)行稀釋，從現(xiàn)有市場(chǎng)上購(gòu)買Cu2+標(biāo)準(zhǔn)樣品，將其在PBS 緩沖液中稀釋以備后續(xù)目標(biāo)離子的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

2.2 傳感器的制備與測(cè)量過(guò)程

本文中使用的叉指電極（IDE）傳感器是通過(guò)PCB 生產(chǎn)工藝制造的，作為基板的玻璃纖維板的厚度被設(shè)計(jì)為1.6mm，叉指電極圖案印刷在基板的銅膜上，借助于鎳結(jié)合層將金膜電鍍?cè)阢~電極上，其總體規(guī)模為3cm×1.5cm，相鄰兩個(gè)叉指電極的間距及單個(gè)叉指的寬度均為0.1mm。將上述規(guī)格的電極經(jīng)過(guò)清洗、貼微型腔室、紫外線、孵育等一系列工作以后，將其兩個(gè)引腳接口連接到阻抗分析儀上可進(jìn)行Cu2+的檢測(cè)工作，如圖2（a）所示，圖2（b）為傳感器表表面叉指電極的局部放大圖。

圖2

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 傳感器的頻譜分析

為了初步判斷適體是否被固定在電極表面，在頻譜測(cè)量之前，可通過(guò)測(cè)量電極孵育前后的電容值進(jìn)行判斷，孵育之后因?yàn)檫m體的綁定會(huì)使得電容值大幅度下降，測(cè)量結(jié)果如圖3 所示，這表明適體被很好的固定在了電極表面，由于6-MCH分子比適體小很多，所以封閉以后電容值下降較小。

阻抗分析在驗(yàn)證傳感器是否被功能化方面也起著相同的作用，我們使用阻抗分析來(lái)分析功能化前后的阻抗參數(shù)，根據(jù)1.2 部分的理論分析可知，在功能化之后，電極表面電容變小并且阻抗模量變大，圖4 表明在適體被固定以后，阻抗模量顯著增加，而在用6-MCH 封閉后，阻抗模量略有增加。

3.2 傳感器的可行性

為了驗(yàn)證本方案的可行性，在頻率為1 kHz、電壓為300 mV 的交流信號(hào)下，對(duì)兩組不同濃度的Cu2+標(biāo)準(zhǔn)液（50 fM、0.5 pM）進(jìn)行可行性實(shí)驗(yàn)，圖5 顯示了使用不同傳感器從三次測(cè)試中獲得的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，可以看到隨著樣品溶液中Cu2+濃度的增加，傳感器歸一化電容響應(yīng)也隨之增大，與此同時(shí)，在同等條件下對(duì)背景緩沖液進(jìn)行了測(cè)量，其響應(yīng)值遠(yuǎn)低于含Cu2+的溶液，這表明傳感器對(duì)背景緩沖液無(wú)響應(yīng)，這也初步證明該適體對(duì)Cu2+是具有特異性的，由此可得本方案作為一種高效的Cu2+監(jiān)測(cè)技術(shù)確實(shí)是可行的。

圖5 傳感器對(duì)不同濃度Cu2+溶液的響應(yīng)

4 總結(jié)

本文提出了一種快速靈敏的Cu2+檢測(cè)技術(shù)，利用ACEK效應(yīng)加速目標(biāo)離子與特異性適體結(jié)合，能夠快速實(shí)時(shí)靈敏的檢測(cè)Cu2+，使用適體功能化電極對(duì)Cu2+進(jìn)行特異性識(shí)別，同時(shí)，傳感器的固液界面電容將反映目標(biāo)離子在傳感器表面的吸附程度，以指示溶液中銅離子的濃度，本研究和已存在的技術(shù)相比，檢測(cè)更加快速，樣品預(yù)處理過(guò)程十分簡(jiǎn)單，這對(duì)于人體中Cu2+的動(dòng)態(tài)平衡和環(huán)境水樣中有害Cu2+的監(jiān)測(cè)具有重大意義。