肺炎支原體肺炎患兒血清micro RNA-21和microRNA-221水平變化及與炎癥因子、T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性*

田偉，梁淳，宋亞娟

（邯鄲市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北 邯鄲056008）

兒童肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP）是常見(jiàn)的社區(qū)獲得性肺部感染疾病之一，是由肺炎支原體感染所致，全年均可能發(fā)病，以秋冬季最高，據(jù)統(tǒng)計(jì)MPP 占兒童社區(qū)獲得性肺部感染疾病的10%～30%[1]。兒童MPP 臨床表現(xiàn)隱匿，在診療過(guò)程中誤診率及漏診率較高，嚴(yán)重影響患兒身體健康，因此，及時(shí)準(zhǔn)確地判斷病情是臨床治療的關(guān)鍵。肺炎支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間可獨(dú)立生存的病原微生物，人類(lèi)是其唯一的宿主，其黏附于宿主細(xì)胞后通過(guò)堆積氧化物直接損傷宿主細(xì)胞，還可擾亂患兒免疫系統(tǒng)功能、改變T 細(xì)胞亞群構(gòu)成及促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)加重患兒病情[2]，但是其具體病理機(jī)制尚未完全清楚，亟待深入研究。microRNA 是長(zhǎng)度約20 個(gè)核苷酸的非編碼小核糖核酸，其可調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的分化、增殖及調(diào)亡等眾多生命過(guò)程，其中的microRNA-21（miR-21）及microRNA-221（miR-221）在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)及激活炎癥反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3-4]，但是關(guān)于MPP 患兒體內(nèi)miR-21 和miR-221 表達(dá)的報(bào)道很少。本研究擬分析MPP 患兒血清miR-21 和miR-221 的水平變化及其與炎癥因子、T 淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系，以期為MPP 的診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月—2019年1月在邯鄲市中心醫(yī)院就診的120 例MPP 患兒為研究對(duì)象（MPP 組）。其中，男性63 例，女性57 例；年齡3～8 歲，平均（5.32±1.35）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①M(fèi)PP 的診斷符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專(zhuān)家共識(shí)（2015 版）》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[5]；②無(wú)心肌炎、小兒哮喘及心包炎等疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①14 d 內(nèi)接受過(guò)抗感染治療；②細(xì)菌感染等呼吸系統(tǒng)疾病；③先天性免疫缺陷疾病。另選取本院同期體檢的健康兒童100 例作為對(duì)照組（CON 組）。其中，男性55 例，女性45 例；年齡4～8 歲，平均（5.68±1.47）歲。兩組年齡和性別構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有兒童家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

①血標(biāo)本采集：清晨采集入組對(duì)象空腹靜脈血2 ml（3 份），一份加入淋巴細(xì)胞分離液分離，分離后6 h 內(nèi)檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞亞群，一份加入RNA 提取劑，置于-80℃冷藏器中備用，一份離心機(jī)3 000 r/min（離心半徑14 cm）離心10 min，取上清液置于-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。②miR-21 和miR-221 的檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR），先經(jīng)RNA 提取試劑盒（德國(guó)QLAGEN 公司）提取總RNA 及檢測(cè)，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒（北京天根生化科技有限公司）合成cDNA，再使用qRT-PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)AB公司）對(duì)miR-21、miR-221 及內(nèi)參引物U6進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，50℃退火1 min，75℃延伸1 min，一共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。miR-21引物：正向5'-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTA TCAGACTGAT-3'，反向5'-ACTGGTGTCGTGGAGTC G-3'；miR-221引物：正向5'-CAGCATACATGATTCC TTGTGA-3'，反向5'-CTTTGGTGTTTGAGATGTTTGG-3'；內(nèi)參引物U6：正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。使 用2-ΔΔCt（ΔCt =樣品Ct 均值-內(nèi)參Ct 均值）法對(duì)miR-21和miR-221 水平進(jìn)行定量分析。③T 淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)：采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，血樣經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解→PBS 清洗液清洗→稀釋至每毫升1×106個(gè)細(xì)胞，最后經(jīng)流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）收集并分析CD3+、CD4+、CD8+，并計(jì)算CD4+/CD8+。④炎癥因子的檢測(cè)：血清樣本解凍后使用880 型酶標(biāo)儀（德國(guó)拜發(fā)儀器公司），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）水平，試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉ±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-21、miR-221水平的比較

兩組血清miR-21、miR-221 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MPP 組高于CON 組。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清miR-21、miR-221水平的比較（±s）

表1 兩組血清miR-21、miR-221水平的比較（±s）

組別MPP組CON組t 值P 值n 120 100 miR-21 2.74±0.58 1.08±0.72 18.939 0.000 miR-221 3.24±1.17 1.19±0.67 15.525 0.000

2.2 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比較

兩組外周血T 淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MPP 組低于CON 組。見(jiàn)表2。

表2 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比較（±s）

表2 兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群的比較（±s）

組別MPP組CON組t 值P 值n 120 100 CD3+/%36.29±7.44 43.56±8.14 6.914 0.000 CD4+/%17.52±6.15 28.15±6.57 12.375 0.000 CD8+/%18.43±5.59 24.51±6.49 7.465 0.000 CD4+/CD8+0.95±0.27 1.15±0.23 5.847 0.000

2.3 兩組炎癥因子的比較

兩組炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-8 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MPP 組高于CON 組。見(jiàn)表3。

表3 兩組炎癥因子的比較 （ng/L, x±s）

2.4 MPP 組患兒血清miR-21、miR-221 水平與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

MPP 組血清中miR-21 和miR-221 與患者外周血中CD3+（r=-0.494 和-0.656，P=0.037 和0.014）、CD4+（r=-0.621 和-0.554，P=0.015 和0.031）、CD8+（r=-0.772 和-0.476，P=0.003 和0.043）、CD4+/CD8+（r=-0.545 和-0.660，P=0.023 和0.014）均呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)圖1。

圖1 MPP組患兒血清miR-21、miR-221水平與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)趨勢(shì)圖

2.5 MPP組患兒血清miR-21、miR-221水平與炎癥因子的相關(guān)性

MPP 組血清中miR-21 和miR-221 與IL-6 （r=0.530 和0.598，P=0.035 和0.029）、IL-8（r=0.665和0.614，P=0.012 和0.017）、TNF-α（r=0.787 和0.619，P=0.000 和0.015）均呈正相關(guān)。見(jiàn)圖2。

圖2 MPP組患兒血清miR-21、miR-221水平與炎癥因子的相關(guān)趨勢(shì)圖

3 討論

MPP 多發(fā)于5～15 歲的兒童，疾病早期臨床中常表現(xiàn)為嚴(yán)重的干咳、頭痛及不規(guī)律發(fā)熱，病情嚴(yán)重時(shí)患兒免疫系統(tǒng)紊亂、全身炎癥反應(yīng)加重，導(dǎo)致心、肝、腦等重要器官損傷，嚴(yán)重威脅患兒生命健康，目前MPP 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，根據(jù)既往的研究報(bào)道其發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)的損傷和過(guò)度炎癥應(yīng)答反應(yīng)[6]，因此明確患兒體內(nèi)免疫損傷機(jī)制及炎癥反應(yīng)發(fā)生機(jī)制是重中之重。

miRNA 一種對(duì)真核細(xì)胞基因表達(dá)有著調(diào)控作用的單鏈小RNA 片段，其參與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化調(diào)亡等過(guò)程，同時(shí)也與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。miR-21 參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，其可通過(guò)Akt 信號(hào)通路抑制抑癌基因PTEN 的表達(dá)而引發(fā)各類(lèi)腫瘤，與原肌球蛋白mRNA 末端結(jié)合上調(diào)原肌球蛋白的表達(dá)可引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，還可以下調(diào)免疫調(diào)控因子FasL 的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸[8]。miR-21 對(duì)炎癥的調(diào)控可能是通過(guò)對(duì)EGFR、NTF3、MAP3K1等基因的調(diào)節(jié)間接調(diào)控MAPK 通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，其在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及T 淋巴細(xì)胞中均有表達(dá)，參與了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等眾多慢性炎癥疾病[9]。林嵐等[10]的研究發(fā)現(xiàn)老年癲癇患者血清中miR-21 表達(dá)上調(diào)，且與炎癥因子IL-2、TNF-α 和CD3+及CD4+T 淋巴細(xì)胞呈正相關(guān)，這也提示了miR-21 參與機(jī)體炎癥反應(yīng)及免疫水平的調(diào)節(jié)。miR-221 可通過(guò)促進(jìn)增殖、遷移、表皮間轉(zhuǎn)化及G1/S 期轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的惡性表達(dá)，還可以通過(guò)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖引發(fā)血管損傷、重塑，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的形成[11]。同時(shí)，miR-221 是目前與MPP 免疫紊亂及過(guò)度炎癥反應(yīng)關(guān)系最為密切的一種miRNA，其可轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)脂聯(lián)素受體1 來(lái)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[12]。王飛等[13]的研究就發(fā)現(xiàn)哮喘患兒及小鼠的肺組織中miR-221 水平明顯上升，且哮喘小鼠肺組織中的炎癥因子（IL-1、IL-4） 水平顯著上升，而使用miR-221 抑制劑后炎癥因子水平顯著下降，這也提示miR-221 參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。本研結(jié)果顯示MPP 患兒miR-21 和miR-221 水平明顯高于健康兒童，且MPP 患兒血清中的炎癥因子水平顯著升高，而T 淋巴細(xì)胞亞群顯著下降，該結(jié)果提示MPP 患兒體內(nèi)免疫功能紊亂及過(guò)度炎癥反應(yīng)可能與miR-21和miR-221 的表達(dá)水平升高有關(guān)。

T 淋巴細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞，正常情況下其數(shù)量保持動(dòng)態(tài)平衡。CD3+T 淋巴細(xì)胞是成熟細(xì)胞，其代表T 細(xì)胞的活化比例。CD4+T 細(xì)胞是輔助細(xì)胞（Th1/2），Th1 細(xì)胞主要分泌IL-2 和TNF-β，Th2 主要分泌IL-4、IL-6、IL-8、IL-10 及TNF-α，正常情況下Th1 和Th2 維持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體感染病原微生物時(shí)，入侵抗原可刺激T 細(xì)胞產(chǎn)生特異性應(yīng)答，兩者動(dòng)態(tài)平衡被打破，機(jī)體會(huì)出現(xiàn)免疫功能紊亂及炎癥介質(zhì)大量釋放[14]。CD8+T 細(xì)胞是抑制性輔助細(xì)胞，主要功能是直接殺傷外來(lái)抗原。CD4+/CD8+代表機(jī)體總體免疫功能，其值下降表示機(jī)體免疫功能受到抑制[15]。本研究結(jié)果顯示MPP 患兒CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+明顯下降，這可能是肺炎支原體感染患兒后，通過(guò)抗原呈遞及其他生物學(xué)機(jī)制引起免疫功能紊亂，機(jī)體成熟T 淋巴細(xì)胞較少，細(xì)胞亞群失衡。

機(jī)體分泌炎癥因子的初衷是防御外來(lái)病原微生物的入侵，但其過(guò)度釋放會(huì)導(dǎo)致機(jī)體損傷。TNF-α 由激活的單核、巨噬及T 細(xì)胞產(chǎn)生，可調(diào)節(jié)機(jī)體適應(yīng)性免疫、促使細(xì)胞凋亡，但有研究[16]顯示TNF-α 分泌過(guò)量可促進(jìn)炎癥反應(yīng)、損傷器官。IL-6由T 細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，可有效刺激B 細(xì)胞的分化，在機(jī)體急性期發(fā)揮重要作用，但過(guò)量的IL-6可誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞分泌大量炎癥因子損傷組織[17]。IL-8 由活化的巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞及T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，可以有效地抑制機(jī)體免疫因子的釋放以控制免疫應(yīng)答，但二者過(guò)量釋放其作用減弱甚至起到促進(jìn)作用[18]。研究結(jié)果顯示MPP 患兒血清各炎癥因子的水平明顯升高，這也與DONG 等[19]的研究相符，提示MPP 患兒體內(nèi)炎癥因子過(guò)度釋放，炎癥反應(yīng)較重，其可能是患者組織損傷的主要機(jī)制之一。

此外，本相關(guān)性研究結(jié)果顯示MPP 組血清中miR-21 和miR-221 與患兒外周血中的各T 淋巴細(xì)胞亞群及CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)，而與各炎癥因子呈正相關(guān)，這提示miR-21 和miR-221 可能通過(guò)調(diào)控MPP 患者免疫系統(tǒng)及炎癥因子的釋放引起組織病理學(xué)損傷。通過(guò)本研究結(jié)果及既往文獻(xiàn)的報(bào)道，高水平miR-21 和miR-221 對(duì)MPP 影響的機(jī)制可能有兩點(diǎn)：①通過(guò)MAPK 及MyD88 等通路導(dǎo)致患兒免疫功能紊亂，成熟T 淋巴細(xì)胞減少進(jìn)而降低機(jī)體總體免疫功能、Th1/Th2 失衡引起大量炎癥因子釋放；②直接刺激炎癥細(xì)胞分泌大量的炎癥因子進(jìn)而引起機(jī)體防御性炎癥反應(yīng)過(guò)度。這也提示臨床可通過(guò)檢測(cè)二者的水平變化以評(píng)估MMP 患兒的免疫狀態(tài)和炎癥反應(yīng)程度，并為患兒臨床診斷及治療方案的制訂提供一定幫助。當(dāng)然，本研究屬于單中心研究，可能代表不了所有MPP 患兒，未來(lái)需要設(shè)計(jì)更多隨機(jī)對(duì)照研究來(lái)驗(yàn)證此結(jié)論。

綜上所述，MPP 患兒血清miR-21 和miR-221的水平明顯升高，且與患者T 淋巴細(xì)胞亞群水平降低、炎癥因子水平升高相關(guān)，及時(shí)監(jiān)測(cè)二者水平變化可以為MPP 的診治提供幫助。