外周血輔助性T細(xì)胞17與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的平衡與白癜風(fēng)臨床特征的相關(guān)性

王小媛, 王穎娟, 康 樂, 曹 偉

(陜西省寶雞市中心醫(yī)院 皮膚科, 陜西 寶雞, 721000)

白癜風(fēng)是一種因皮膚黑素細(xì)胞功能消失或數(shù)量減少引起的后天色素脫失性皮膚病，好發(fā)于面部、背側(cè)、四肢末端等部位[1]。根據(jù)白癜風(fēng)病史及體征，可將白癜風(fēng)分為進(jìn)展期和穩(wěn)定期2個(gè)階段。目前研究[2]認(rèn)為白癜風(fēng)是一種多基因遺傳的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要與遺傳、自身免疫、氧化應(yīng)激等有關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。輔助性T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是CD4+T細(xì)胞的2個(gè)亞群，Th17細(xì)胞主要通過分泌炎癥細(xì)胞因子如白介素-17(IL-17)、白介素-22(IL-22)等介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，Treg細(xì)胞則主要是通過直接接觸有效的免疫細(xì)胞來維持自身耐受性，從而抑制自身免疫[3]。Th17與Treg細(xì)胞能夠相互影響，與相應(yīng)的細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究[4-6]表明Th17/Treg細(xì)胞失衡與包括白癜風(fēng)在內(nèi)的多種自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。本研究對白癜風(fēng)患者外周血Th17、Treg細(xì)胞數(shù)量及相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，分析Th17/Treg細(xì)胞平衡與白癜風(fēng)臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院皮膚科門診2017年4月—2018年6月確診的白癜風(fēng)患者109例，其中白癜風(fēng)進(jìn)展期患者56例，男31例，女25例，年齡8～60歲，平均(23.15±7.66)歲，平均病程(32.61±11.35)個(gè)月; 白癜風(fēng)穩(wěn)定期患者53例，男29例，女24例，年齡7～58歲，平均(22.53±6.87)歲，平均病程(31.78±15.62)個(gè)月。根據(jù)外科常用體表面積算法，手掌面積為其體表面積的1%, 將患者分為皮損面積<1%者38例, 1%～10%者45例, >10%者26例。

白癜風(fēng)診斷參考《白癜風(fēng)診療共識(shí)(2018版)》[7]中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 臨床及病理診斷為白癜風(fēng)患者; ② 3個(gè)月內(nèi)未接受紫外線、免疫抑制劑等系統(tǒng)治療者; ③ 患者知情并同意參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 白癜風(fēng)合并暈痣患者; ② 患有其他自身免疫系統(tǒng)疾病者; ③ 肝、腎等臟器功能不全者; ④ 妊娠期和哺乳期婦女; ⑤ 免疫功能低下者。選取本院健康體檢者59例為對照組，男33例，女26例，年齡8～62歲，平均(24.24±8.13)歲。本研究經(jīng)本院倫理道德委員會(huì)審核通過。

1.2 主要試劑及儀器

淋巴細(xì)胞分離液，購自美國Sigma公司; 鼠抗人CD3-APC、CD4-FITC、CD25-PE、IL-17A-PE、Foxp3-APC抗體，購自美國eBioscience公司; 破膜劑(Fix/Perm)、固定劑/破膜劑(Perm/Wash)購自美國BD公司; 佛波酯(PMA)、離子霉素購自美國Sigma公司; FACS calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。IL-17、叉頭盒蛋白P3(Foxp3)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自上海藍(lán)基生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血液樣本采集: 抽取白癜風(fēng)患者及對照組體檢者空腹外周靜脈血7 mL, 2 mL置于普通離心管中, 4 ℃下3 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min, 取上清并保存在-80 ℃冰箱。其余血樣置于EDTA抗凝管中，立即行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3.2 單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離: 滅菌離心管中加入5 mL淋巴分離液，之后加入EDTA抗凝血, 4 ℃下3 000 轉(zhuǎn)/min離心20 min, 此后采用密度梯度法分離PBMC。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17、Treg細(xì)胞: 準(zhǔn)備Treg細(xì)胞檢測，將PBMC細(xì)胞懸浮液稀釋至1×106個(gè)/mL, 之后吸取100 μL加至流式管中，依次加入鼠抗人CD4-FITC、CD25-PE抗體，并混合均勻, 4 ℃遮光孵育; 此后加入流式細(xì)胞染色緩沖液(PBS), 混勻，離心，棄上清; 再加Fix/Perm重懸細(xì)胞, 4 ℃遮光孵育，再加入Fix/Perm, 離心棄上清; 在細(xì)胞懸液中加入正常大鼠血清進(jìn)行阻斷, 4 ℃遮光孵育，加入Foxp3-APC抗體, 4 ℃遮光孵育; 再加入Fix/Perm, 離心，棄上清; 最后加入固定液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上檢測Treg細(xì)胞。準(zhǔn)備Th17細(xì)胞檢測，取PBMC細(xì)胞懸浮液，加入至24孔培養(yǎng)板中，依次加入PMA、離子霉素和阻斷劑，置于CO2培養(yǎng)箱中, 35 ℃、5%CO2孵育4 h, 此后收集細(xì)胞，離心，棄上清; 加入PBS重懸細(xì)胞，加入鼠抗人CD3-APC、CD4-FITC, 混勻, 4 ℃遮光孵育; 再加入PBS, 混勻，離心，棄上清; 加入破膜打孔液，混勻, 4 ℃遮光孵育; 加入Perm/Wash, 離心，棄上清; 加入IL-17A-PE單抗，混勻, 4 ℃遮光孵育，再加入Perm/Wash緩沖液進(jìn)行洗滌，離心，棄上清; 加入固定液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞。

1.3.4 ELISA檢測細(xì)胞因子水平: 采用ELISA試劑盒檢測IL-17、Foxp3水平，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較

3組受試者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 白癜風(fēng)進(jìn)展期組及白癜風(fēng)穩(wěn)定期組患者面部發(fā)病率均高于其他部位，但組間顏面、手足、四肢及軀干發(fā)病率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組受試者一般資料比較

2.2 3組受試者外周血Th17、Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子水平比較

與對照組比較，白癜風(fēng)進(jìn)展期組和白癜風(fēng)穩(wěn)定期組患者Th17細(xì)胞含量、Th17/Treg、IL-17水平升高，Treg細(xì)胞含量、Foxp3水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與白癜風(fēng)穩(wěn)定期組患者比較，白癜風(fēng)進(jìn)展期組患者Th17細(xì)胞含量、Th17/Treg、IL-17水平較高, Treg細(xì)胞含量、Foxp3水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組受試者外周血Th17、Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子水平比較

2.3 不同皮損面積白癜風(fēng)患者外周血Th17、Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子水平比較

與白癜風(fēng)皮損面積<1%組患者比較，皮損面積1%～10%組、>10%組患者Th17細(xì)胞含量、Th17/Treg、IL-17水平升高，Treg細(xì)胞含量、Foxp3水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與皮損面積1%～10%組患者比較，皮損面積>10%組患者Th17細(xì)胞含量、Th17/Treg、IL-17水平較高，Treg細(xì)胞含量、Foxp3水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同皮損面積白癜風(fēng)患者外周血Th17、Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子水平

2.4 白癜風(fēng)患者Th17、Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子的相關(guān)性

白癜風(fēng)患者Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.449,P<0.05), 血清IL-17與Foxp3水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.497,P<0.05), 見圖1、2。

3 討 論

白癜風(fēng)是一種慢性自身免疫性疾病，產(chǎn)生的白斑病變嚴(yán)重影響患者的身心健康，尤其是青少年患者。壓力、曬傷、妊娠、感染等多種不良刺激均可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)失調(diào)，從而引發(fā)白癜風(fēng)。白癜風(fēng)免疫學(xué)說[8]認(rèn)為白癜風(fēng)是因自身免疫細(xì)胞攻擊黑素細(xì)胞導(dǎo)致黑素細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致白斑的產(chǎn)生。研究表明Th17/Treg細(xì)胞失衡參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[9]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[5]、自身免疫性肝病[10]等自身免疫性疾病。臨床研究[11]表明白癜風(fēng)常伴發(fā)一些自身免疫性疾病，如自身免疫甲狀腺疾病，且患有自身免疫性疾病患者白癜風(fēng)發(fā)病率較一般人群高10～15倍。本研究結(jié)果表明，白癜風(fēng)患者存在Th17/Treg細(xì)胞失衡，提示白癜風(fēng)與其他自身免疫性疾病可能具有相似的發(fā)病機(jī)制。

CD4+T細(xì)胞在受到外來抗原刺激后會(huì)增殖、分化為各種效應(yīng)的T細(xì)胞，包括Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生多種炎癥細(xì)胞因子，參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。Th17細(xì)胞因能夠大量分泌IL-17而被命名為Th17細(xì)胞, Th17細(xì)胞還可以分泌IL-22、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種細(xì)胞因子，參與機(jī)體的自身免疫，發(fā)揮特定功能[12]。IL-17能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和趨化因子，參與炎癥發(fā)展、免疫應(yīng)答和免疫排斥等多種生物學(xué)過程，與多種免疫性疾病的發(fā)生機(jī)制有關(guān)[13]。線粒體功能障礙可誘導(dǎo)過量活性氧產(chǎn)生，是多種炎癥和自身免疫性疾病的潛在機(jī)制，研究[14]表明IL-17能夠抑制正常人表皮黑素細(xì)胞的生成，而IL-17能夠促進(jìn)線粒體功能障礙和活性氧的積累，從而誘導(dǎo)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞的凋亡?；艟У萚15]研究表明，白癜風(fēng)患者外周血Th17水平、血清IL-17水平均顯著高于正常對照組，且進(jìn)展期白癜風(fēng)患者Th17、IL-17水平高于穩(wěn)定期患者。本研究結(jié)果表明，白癜風(fēng)患者外周血Th17細(xì)胞水平、IL-17表達(dá)水平均高于對照組，且白癜風(fēng)進(jìn)展期患者高于穩(wěn)定期患者，隨著白癜風(fēng)患者皮損面積的增加，外周血Th17細(xì)胞及IL-17表達(dá)顯著升高，提示Th17、IL-17可能與白癜風(fēng)的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。

Treg細(xì)胞是除Th1、Th2、Th17之外的T細(xì)胞亞群，能夠分泌多種細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)，在免疫平衡中具有免疫抑制的作用。Foxp3是叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，是Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其能夠與染色體特異性結(jié)合而影響Treg細(xì)胞的增殖與分化，從而參與免疫調(diào)節(jié)。ZHANG Q等[16]研究表明，活動(dòng)期白癜風(fēng)患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量顯著減少，且相應(yīng)的細(xì)胞因子IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達(dá)也相應(yīng)降低。BHARDWAJ S等[17]研究表明，非節(jié)段性白癜風(fēng)患者Foxp3 mRNA水平顯著降低。本研究結(jié)果表明，白癜風(fēng)患者Treg細(xì)胞、Foxp3水平均低于對照組，進(jìn)展期患者Treg細(xì)胞、Foxp3水平低于穩(wěn)定期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Treg細(xì)胞可能參與白癜風(fēng)發(fā)病，原因可能是Treg細(xì)胞引起白癜風(fēng)患者的免疫失常。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞在細(xì)胞免疫功能上相互抑制，TGF-β是Treg與Th17細(xì)胞分化共同的調(diào)控因子，僅TGF-β存在的條件下，可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化和維持免疫耐受，但在炎癥因子存在的條件下, TGF-β可以誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化，且可以誘導(dǎo)Foxp3表達(dá)的減少，并且在炎性條件下, Treg細(xì)胞能夠產(chǎn)生IL-17, 從而轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞，導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞的失衡[3]。本研究結(jié)果表明，進(jìn)展期、穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者Th17/Treg均顯著高于對照組，且白癜風(fēng)患者血清Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān), IL17與Foxp3呈顯著負(fù)相關(guān)?？傊? Th17/Treg細(xì)胞平衡可能與白癜風(fēng)的發(fā)生及臨床特征有關(guān)。