p16、微型染色體維持蛋白2、Ki-67在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變的表達(dá)與意義

蔣莉萍，吳鳳珍，肖 艷，胡利娟，劉媛媛

（1.吉安市婦幼保健院病理科；2.吉安市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江西 吉安 343006）

宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）是一組與宮頸浸潤(rùn)癌密切相關(guān)的癌前病變的統(tǒng)稱，以CINⅠ為低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL），CIN Ⅱ級(jí)、CIN Ⅲ級(jí)為高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL），因此早期診斷與治療子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（squamous intraepithelial lesion, SIL）是降低宮頸癌發(fā)病率與死亡率的關(guān)鍵。p16是多種腫瘤抑制基因，是一種細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑，其被視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）介導(dǎo)的G1/S期轉(zhuǎn)化所調(diào)控，可在持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染機(jī)體中過(guò)度表達(dá)并導(dǎo)致細(xì)胞周期失控；Ki-67是一種最常用的細(xì)胞核增殖標(biāo)志物，可表達(dá)于除G0期之外的各細(xì)胞周期階段；p16與Ki-67均可作為細(xì)胞周期調(diào)控失調(diào)的標(biāo)志物，其水平與HR-HPV誘導(dǎo)的癌性轉(zhuǎn)化相關(guān)，但因p16存在假陽(yáng)性和陰性的情況，且Ki-67特異性有待提高，所以需聯(lián)合其他分子標(biāo)志物來(lái)提高SIL的診斷準(zhǔn)確度[1-2]。微小染色體維持蛋白2（MCM2）是一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物，在真核細(xì)胞DNA復(fù)制的起始和延伸過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)其只表達(dá)處于增殖活動(dòng)周期的細(xì)胞內(nèi)，若陰性表達(dá)，則意味著細(xì)胞退出細(xì)胞的增殖周期，成為分化成熟的細(xì)胞或進(jìn)入G0期，因此MCM2蛋白也可以作為細(xì)胞增殖的特殊標(biāo)記物[3]。但目前關(guān)于MCM2在SIL組織中的表達(dá)情況研究較少，因此本研究旨在探討p16、MCM2、Ki-67在SIL中的表達(dá)意義，并分析三者陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性，現(xiàn)將研究結(jié)果詳細(xì)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析吉安市婦幼保健院2017年7月至2019年10月收治的240例CIN患者的臨床資料，年齡18～68歲，平均（40.66±9.15）歲；另回顧性分析同期收治的50例慢性宮頸炎患者的臨床資料，年齡35～66歲，平均（45.74±9.29）歲；另回顧性分析同期收治的20例宮頸浸潤(rùn)性鱗癌患者的臨床資料，年齡25～61歲，平均（44.64±8.43）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《WHO（2014）女性生殖器官腫瘤分類解讀》[4]中關(guān)于CIN與宮頸癌的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均對(duì)應(yīng)符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；均經(jīng)宮頸活檢、宮頸管診刮檢查，并經(jīng)病理診斷確診；均已婚；年齡18周歲以上；已婚或有過(guò)性生活史；CIN及宮頸浸潤(rùn)性鱗癌患者進(jìn)行宮頸LEEP術(shù)切除治療，慢性宮頸炎患者經(jīng)保守治療；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：接受相關(guān)放化療治療者；妊娠或哺乳期婦女；合并其他惡性腫瘤及其他器質(zhì)性病變者等。3組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），組間具有可比性。本研究已經(jīng)吉安市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)MCM2、p16、Ki-67在病理組織中的表達(dá)情況：病理標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)制作石蠟組織切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，所涉一抗：兔抗人MCM2單克隆抗體（克隆號(hào)：EP40），鼠抗人p16單克隆抗體（克隆號(hào)：1C1），鼠抗人Ki-67單克隆抗體（克隆號(hào)：UMAB107），均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。將已知的陽(yáng)性組織作陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定方法 采用半定量評(píng)分法據(jù)每張切片陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色程度進(jìn)行計(jì)分。①p16陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿，根據(jù)細(xì)胞核和或細(xì)胞漿染色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分：無(wú)表達(dá)為0分；淡黃色為1分；（+）黃色為2分；（++）棕黃色為3分；據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比將結(jié)果分為<10%為（-），計(jì)0分；11%～25%為（+），計(jì)1分；26%～50%為（++），計(jì)2分；51%～75%為（+++），計(jì)3分；>76%為（++++），計(jì)4分。②MCM2和Ki-67陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞分布情況判定：陽(yáng)性細(xì)胞在鱗狀上皮分布的垂直平面，由下向上，基底層與基底旁細(xì)胞著色判為（-），計(jì)0分；將基底旁細(xì)胞以上至表層分為2份，下1/2細(xì)胞著色判為（+），計(jì)1分；超過(guò)下1/2細(xì)胞著色判為（++），計(jì)2分；染色強(qiáng)度評(píng)分方法同p16。p16、MCM2、Ki-67免疫組化染色評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分+陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分，分值范圍0～7分，其中 < 2分為（-）；2～3分為（+），≥4分（++）。經(jīng)3位病理高級(jí)醫(yī)師判定，在判定結(jié)果中若同一病例存在不同評(píng)分視野，則取最大值和最小值的平均值；參考半定量標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度評(píng)分。結(jié)果均經(jīng)2次重復(fù)觀察，計(jì)分不一致者再次觀察確認(rèn)。

1.3 觀察指標(biāo) ①觀察典型病例p16、MCM2、Ki-67免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；②統(tǒng)計(jì)并比較不同患者病理組織中p16、MCM2、Ki-67 陽(yáng)性表達(dá)情況；③分析 p16、MCM2、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；雙變量相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析。以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p16、MCM2、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)情況 p16在正常子宮頸鱗狀上皮組織中呈陰性表達(dá)（-），見(jiàn)圖1-A；在LSIL組織中呈陽(yáng)性表達(dá)（+），上皮基底層及副基底層細(xì)胞連續(xù)彌漫陽(yáng)性，見(jiàn)圖1-B；在HSIL、鱗癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)（++），全層彌漫陽(yáng)性，見(jiàn)圖1-C。MCM2、Ki-67在正常子宮頸鱗狀上皮基底層組織中呈陰性表達(dá)（-），見(jiàn)圖2-A、圖3-A；MCM2、Ki-67在LSIL組織呈陽(yáng)性表達(dá)（+），上皮下1/2區(qū)域陽(yáng)性，見(jiàn)圖2-B、圖3-B；MCM2、Ki-67在HSIL和鱗癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)（++），全層彌漫陽(yáng)性，見(jiàn)圖 2-C、圖3-C。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，CIN Ⅰ級(jí)、CIN Ⅱ～Ⅲ級(jí)、浸潤(rùn)性鱗癌患者病理組織中p16、MCM2、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于慢性宮頸炎患者，且CINⅡ～Ⅲ級(jí)、浸潤(rùn)性鱗癌患者顯著高于CINⅠ級(jí)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P< 0.05），見(jiàn)表1、表2、表3。

表1 不同宮頸病變患者病理組織p16陽(yáng)性表達(dá)情況比較

表2 不同宮頸病變患者病理組織MCM2陽(yáng)性表達(dá)情況比較

表3 不同宮頸病變患者病理組織Ki-67陽(yáng)性表達(dá)情況比較

2.2 p16、MCM2、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析顯示，p16與MCM2陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r= 0.691）；p16與Ki-67陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r= 0.556）；MCM2與Ki-67陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r= 0.676），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)表4。

表4 p16、MCM2、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

眾所周知，宮頸癌癌前病變病理組織學(xué)診斷中CIN分級(jí)的不一致性問(wèn)題一直存在，尤其對(duì)于一些年輕且診斷經(jīng)驗(yàn)不足的病理診斷醫(yī)師和非婦科病理醫(yī)師來(lái)說(shuō)，普遍存在CINⅡ級(jí)的低診斷率現(xiàn)象。CINⅡ級(jí)屬于一種生物學(xué)上模棱兩可的病變，在現(xiàn)實(shí)工作中其診斷的可重復(fù)性差。近年來(lái)，p16、Ki-67雖已在輔助宮頸癌前病變的病理診斷中廣泛應(yīng)用，但p16、Ki-67的表達(dá)與細(xì)胞病變程度常常不一致，并受外界因素干擾較大，且p16、Ki-67對(duì)低危型人乳頭瘤病毒（LR-HPV）感染所致的宮頸病變易漏診和誤診[5]。因此，尋找敏感度與特異度更高的分子標(biāo)志物在臨床診斷中意義重大。

在沒(méi)有免疫組化輔助手段的診斷時(shí)代，病理診斷醫(yī)師只能借助各自積累的經(jīng)驗(yàn)來(lái)判斷。LAST項(xiàng)目認(rèn)為，當(dāng)形態(tài)學(xué)不能診斷為CINⅠ級(jí)、CINⅢ級(jí)時(shí)，為了盡可能地降低誤診而不贊成過(guò)度使用p16，同時(shí)不提倡在LSIL診斷中采用p16的免疫組化，其認(rèn)為，在蘇木精-伊紅（HE）染色為L(zhǎng)SIL的前提下，p16免疫組化對(duì)于預(yù)后并無(wú)預(yù)測(cè)意義；不能因?yàn)閜16陰性或斑片狀陽(yáng)性而將病變級(jí)別降為陰性，也不能因核漿彌漫著色、強(qiáng)陽(yáng)性、點(diǎn)狀著色p16表達(dá)陽(yáng)性而將其病變升級(jí)為HSIL[6]。當(dāng)患者為L(zhǎng)R-HPV感染所致的CINⅠ級(jí)病變時(shí)，p16常常顯示陰性或局灶斑片著色，而MCM2此時(shí)大多能標(biāo)記副基底層以上的細(xì)胞（大于黏膜厚度的25%～30%），故說(shuō)明MCM2恰好能彌補(bǔ)p16的缺陷和不足。因此，依靠MCM2獲得診斷信息而增加CINⅠ級(jí)的診斷依據(jù)，并與Ki-67標(biāo)記的增殖指數(shù)相結(jié)合，能更好地輔助HE切片病理診斷。對(duì)于微小不易發(fā)現(xiàn)或極易漏診的病灶，MCM2也能和p16一樣將病變處凸顯出來(lái)，增加異常病變的檢出率[7]。本研究結(jié)果顯示，CINⅠ級(jí)、CINⅡ～Ⅲ級(jí)、浸潤(rùn)性鱗癌患者病理組織中MCM2、Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于慢性宮頸炎患者，且 CINⅡ～Ⅲ級(jí)、浸潤(rùn)性鱗癌患者顯著高于CINⅠ級(jí)患者，提示MCM2與Ki-67能準(zhǔn)確地反映鱗狀上皮細(xì)胞的增殖程度。

MCM2作為DNA復(fù)制許可蛋白和前復(fù)合物的重要組成成分，在DNA復(fù)制啟動(dòng)和DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖與惡變傾向[8]。HR-HPV在宮頸癌前病變中發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，其通過(guò)E6、E7癌蛋白與抑癌蛋白P53和pRb結(jié)合及調(diào)控來(lái)明顯改變細(xì)胞生長(zhǎng)周期和影響DNA修復(fù)，從而促發(fā)癌變；E7蛋白降低了pRb的穩(wěn)定性，而pRb減少會(huì)致p16的高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖而瘤變[9]。E6、E7癌蛋白也可與其他分子結(jié)合來(lái)破壞細(xì)胞增殖，并通過(guò)E2F轉(zhuǎn)錄因子途徑介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄異常激活和異常S期誘導(dǎo)而致MCM2過(guò)表達(dá)，而p16過(guò)表達(dá)又會(huì)通過(guò)E2F轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的細(xì)胞周期異常激活途徑使MCM2過(guò)表達(dá)而惡變[10]。本研究結(jié)果顯示，MCM2與p16、Ki-67的表達(dá)均呈正相關(guān)，p16與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)，故p16、MCM2、Ki-67三者之間的表達(dá)具有明顯相關(guān)性，呈正相關(guān)。

綜上，慢性宮頸炎患者、CIN患者及浸潤(rùn)性鱗癌患者宮頸組織中p16、MCM2、Ki-67均異常高表達(dá)，且三者陽(yáng)性表達(dá)均與SIL病變嚴(yán)重程度正相關(guān)，p16、MCM2、Ki-67三者陽(yáng)性表達(dá)也具有顯著正相關(guān)性；提示將MCM2加入SIL病變的日常診斷中，可以使SIL，尤其是LSIL的病理診斷更精準(zhǔn)，值得臨床進(jìn)一步深入研究。