橘子中維生素C穩(wěn)定性的研究

何飛強(qiáng)，王尚賢，熊方永，張 英，丁健樺

(東華理工大學(xué) 化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330013)

維生素C(L-抗壞血酸，簡稱VC)是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)，是維持機(jī)體正常生命活動所必需的一類小分子有機(jī)化合物，具有抗氧化、解毒、促進(jìn)機(jī)體對鈣、鐵等人體必需元素的吸收作用，其主要的生理功能有促進(jìn)膠原蛋白及結(jié)締組織的合成、促進(jìn)傷口愈合和增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高酶活性，預(yù)防癌癥等(陳國峰等，2014；曾翔云，2005)。盡管VC對人體非常重要，但是人體缺乏古洛糖內(nèi)酯氧化酶，不能自身合成VC，必須從天然食物、強(qiáng)化食品或藥物中獲取。但過多或過少攝入VC都不利于健康，嚴(yán)重時會引起病變等不良反應(yīng)。如缺乏VC可引起壞血病；過量攝入VC會引起皮疹、結(jié)石、動脈硬化等疾病(陳莉，2012)。因此補(bǔ)充VC時應(yīng)注意控制用量，根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的水溶性維生素攝入的衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(中國營養(yǎng)學(xué)會，2018)，成年人對VC的日平均需要量(EAR)為85 mg/d、推薦攝入量(RNI)為100 mg/d，可耐受最高攝入量(UL)為2 000 mg/d；而未成年人對VC的攝入標(biāo)準(zhǔn)低于成年人，但即使一歲兒童其EAR、RNI、UL分別不低于35 mg/d、40 mg/d、400 mg/d。因此，對日常食物或藥物中VC含量進(jìn)行測定，使人們了解和控制自身VC攝入量非常重要。

目前VC測定的方法一般有滴定法、碘量法、比色法、熒光法、紫外分光光度法等(趙平娟等，2017)，這些方法具有試劑用量多、操作復(fù)雜等不足。高效液相色譜(HPLC)法則具有試劑用量相對較少、操作簡單、省時省力，以及穩(wěn)定快速、高效分離和運行自動化等優(yōu)點(曹博等，2013；梁華正等，2012)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、藥品中維生素、有機(jī)酸、氨基酸等的檢測(Shahdousti et al., 2018; Pullar et al., 2018)。近十幾年來，HPLC法測定VC含量的方法也得到了充分的發(fā)展和完善。

由于VC在常態(tài)下不太穩(wěn)定，易被氧化(李軍明等，2009)，易受溫度、pH、光照等條件的影響(Ramesh et al., 2010)，因此結(jié)合日常生活經(jīng)驗，較系統(tǒng)地研究了時間、溫度、光照以及廚房調(diào)味料和茶水等介質(zhì)對VC穩(wěn)定性的影響。本研究利用HPLC分析橘子中VC的含量，取得了比較滿意的結(jié)果。不但可為人們根據(jù)營養(yǎng)需求合理選擇和科學(xué)搭配果蔬提供科學(xué)依據(jù)，也可為果蔬中VC的保存、提取以及利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橘子、食鹽、食醋和食用堿等調(diào)味料及茶葉均購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

草酸(分析純)、 天津市大茂化學(xué)試劑廠；VC(分析純) 購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實驗所用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀LC-15C (配有SPD-15C紫外-可見檢測器和LC solution 15C色譜工作站，日本島津公司)；循環(huán)水式真空泵(SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市予華儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司)；電子分析天平(BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

(1)草酸溶液的配制。稱取1.000 0 g草酸固體，用純水溶解、轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中定容，得到0.1%的草酸溶液。

(2)標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制?？焖贉?zhǔn)確稱取0.250 0 g VC標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL的燒杯中，用0.1% 的草酸溶解，轉(zhuǎn)移至250 mL棕色容量瓶中，并用0.1%的草酸溶液定容，得到1.00 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，避光貯存，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 橘子樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取橘子果肉20.0 g，迅速切碎置于研缽中研成勻漿后迅速移入100 mL燒杯，再用25 mL移液管分兩次準(zhǔn)確移取25.00 mL 0.1%的草酸溶液清洗研缽，并將清洗液轉(zhuǎn)移至上述燒杯中，精密稱重，再將其置于超聲波清洗儀中超聲15 min輔助提取。超聲后再精密稱重，用0.1%的草酸溶液補(bǔ)重。隨后溶液用0.45 μm濾膜過濾得到目標(biāo)溶液。用移液管準(zhǔn)確移取續(xù)濾液10.00 mL于50 mL容量瓶，用0.1%的草酸溶液定容得到橘子樣品溶液。將該樣品溶液超聲5 min，過0.45 μm濾脫，進(jìn)行HPLC分析。

1.3.3 調(diào)味料和茶水等溶液的制備

分別稱取0.10 g食鹽、食用堿和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品，用純水溶解并分別轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，再用0.1%草酸溶液定容，配成食鹽溶液、食用堿溶液和蔗糖溶液；稱取5.0 g普通茶葉于250 mL的玻璃杯中用開水封閉浸泡4小時制成茶水，再將上述配好的溶液以及購買的食醋分別用0.45 μm濾膜過濾，過濾后超聲7 min。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Accurasil-C18柱；檢測器：SPD-15C紫外-可見檢測器(島津，250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長：255 nm；流動相：0.1%的草酸溶液；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4 VC剩余率的計算

(1)

式中，A0為樣品溶液中VC的起始含量；A為樣品溶液在不同條件下所對應(yīng)的VC含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 VC的HPLC法測定

2.1.1 色譜條件的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)(Klimczak et al., 2015; 王敬等，2014)同時結(jié)合VC的性質(zhì)，色譜柱采用C18柱，選擇0.1%的草酸作為流動相，其他條件分別為流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20.0 μL，檢測波長255 nm。在該色譜條件下，濃度為1.00 mg/L的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。由圖可見VC的峰形好且無VC的氧化物干擾峰，能滿足VC分析的需求。

圖1 VC標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.1 Standard chromatogram of vitamin C

2.1.2 VC的線性精密度和檢出限

用1.00 g/L的VC標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋配制系列濃度的VC標(biāo)準(zhǔn)液，在所選色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測。以VC峰面積對濃度繪制校準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，在0.10～6.00 mg/L濃度范圍內(nèi)，VC標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性回歸方程為y=330 32x+3 233.3，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6，表明VC標(biāo)準(zhǔn)溶液在該濃度范圍內(nèi)線性良好。

將0.50 mg/L的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液，在所選色譜條件下連續(xù)重復(fù)測定11次，得到VC檢測精密度，再根據(jù)檢出限計算公式LOD = 3σc/S(式中：σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差，c為VC標(biāo)準(zhǔn)品濃度，S為相應(yīng)信號強(qiáng)度的平均值)，計算出VC的檢出限(表1)。從表1可以看出本法檢測VC具有重現(xiàn)性好、檢出限低等優(yōu)點。

表1 VC檢測的精密度和檢出限Table 1 Precision and detection limits on the determination of vitamin C

2.1.3 樣品測定和加標(biāo)回收

將購買的同一批3個外表健康、顏色均勻的橘子分別標(biāo)為1、2、3號樣品，并按前述預(yù)處理的方法進(jìn)行處理，然后進(jìn)行HPLC檢測，每個樣品平行測定3次，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中VC濃度，再計算出每100 g該橘子所含VC的量(表2)，并將此數(shù)據(jù)作為下文探究橘子樣品中VC穩(wěn)定性的起始值。

表2 橘子樣品分析結(jié)果Table 2 Results of analysis on orange samples

在體積均為50 mL的1、2、3號樣品中分別添加150 μg的VC標(biāo)準(zhǔn)品，超聲處理5 min后，每個樣品平行測3次，得到加標(biāo)回收率(表3)。

表3 橘子樣品的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of orange samples

2.2 VC穩(wěn)定性的探究

2.2.1 時間、溫度和光照對VC穩(wěn)定性的影響

將1、2、3號橘子樣品剝開后分別在室溫光照、室溫避光和低溫避光3個條件下放置0 h (即剛剝開時的檢測結(jié)果，表2)、6 h、18 h、24 h后按前述方法進(jìn)行處理和測定，檢測對應(yīng)的VC含量，考察VC隨時間、溫度和光照的變化情況。將橘子樣品的VC含量隨放置時間的變化做折線圖(圖2)。

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，1號樣品擱置24 h后局部出現(xiàn)腐爛情況，而2號和3號樣品依舊完好，故推斷除了低溫有利于防腐外，VC的散失也會加劇食品的腐爛，這跟VC的抗氧化性是一致的。即VC可能具有防腐的功能。

由圖2可知，隨著時間的增加，3個樣品VC含量均減少了(放置24 h后減少35%以上)，但減少的程度各不相同。對比1、2號樣品發(fā)現(xiàn)，光照會使VC加速分解；對比2、3號樣品發(fā)現(xiàn)，低溫能減緩VC的分解；對比1、2、3號樣品發(fā)現(xiàn)，在避光和低溫共存的條件下，VC分解最少?？梢姡瑸榉乐归僮又蠽C流失，應(yīng)盡量將其保存至低溫、避光環(huán)境中，且剝開后的橘子不應(yīng)長期保存。

圖2 橘子樣品中VC含量隨時間的變化圖Fig.2 Changes in vitamin C quantity in orange samples over time

由圖2可見，在0～24小時內(nèi)，隨著時間的延長，在各條件下VC含量均逐漸減少，且分解速率呈減緩的趨勢。這可能是因為VC的分解大致包括兩個過程(高晗等，2008)：第一個過程為抗壞血酸(還原態(tài))氧化生成脫氫抗壞血酸(氧化態(tài))和脫氫抗壞血酸還原生成抗壞血酸的過程，這個過程是可逆的；第二個過程是抗壞血酸氧化生成脫氫抗壞血酸，而后直接進(jìn)行不可逆分解的過程。因此，兩個過程綜合作用的結(jié)果是隨時間延長，VC的分解逐漸達(dá)到平衡，分解速率會逐漸減緩，但是不存在VC不再分解的時間點。

假設(shè)橘子中VC以下列反應(yīng)式降解：

nA→產(chǎn)物

(2)

根據(jù)VC降解的相關(guān)文獻(xiàn)報道，VC的降解大部分呈現(xiàn)一級反應(yīng)動力學(xué)模型。為此，本次研究進(jìn)行相關(guān)驗證，假設(shè)n=1。上式可簡化為：

(3)

(4)

lnc=-kt+C1

(5)

式(2)至(5)中，r為VC的降解速率,mg/(100 g·h)；c為VC在任意時刻t的濃度,mg/100 g；k為降解速率常數(shù)；C1為常數(shù)。

通過對lnc-t作圖，發(fā)現(xiàn)不同條件下的 lnc-t呈線性關(guān)系，且線性相關(guān)性較高，R2均在 0.97以上，這表明此反應(yīng)符合一級反應(yīng)模型，驗證了橘子中VC符合一級反應(yīng)降解規(guī)律。

結(jié)合圖3中方程，得到1號、2號和3號樣品中VC分解的速率常數(shù)k分別為0.024 18 h-1、0.020 44 h-1、0.019 44 h-1，該值直接反映了反應(yīng)速率的快慢，對確定反應(yīng)歷程、設(shè)計合理的反應(yīng)器以及保存運輸?shù)忍峁┝酥匾罁?jù)。

圖3 lnc與t線性擬合圖Fig.3 Plots of lnc to t

2.2.2 調(diào)味料和茶水等介質(zhì)對VC穩(wěn)定性的影響

為了更加貼近生活實際，探究了食鹽、食醋、食用堿、蔗糖等生活中常用調(diào)味料以及飲用水、茶水等對VC的影響。將食鹽、食用堿、蔗糖、茶水等按1.3.3的方法配成溶液。分別將同批購買的6個橘子(依次編號為4、5、6、7、8、9號)按1.3.2的方法提取后，各取10.0 mL樣品初始溶液，依次加入6個50 mL的棕色容量瓶中。然后分別加入飲用水、食鹽水、食醋、食用堿溶液、蔗糖溶液、茶水5 mL，再用0.1%的草酸溶液依次定容，配成4至9號樣品溶液。將這6種溶液在室內(nèi)環(huán)境(室溫，自然光)下擱置0 h (即起始測得值)、2 h、4 h、6 h時，在1.3.4的色譜條件下分別檢測VC含量，再根據(jù)1.4中剩余率的計算公式求出0 h、2 h、4 h、6 h所對應(yīng)的剩余率(表4)。

表4 調(diào)味料和茶水等介質(zhì)對VC 穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of seasoning and tea water on the stability of VC

由表4可知，飲用水、食鹽、食醋、食用堿、蔗糖和茶水等介質(zhì)對VC的分解有不同程度的影響。其中VC在堿性介質(zhì)(如食用堿)中最易分解，中性介質(zhì)(如飲用水)中次之、酸性介質(zhì)(如食醋)中分解最慢。與飲用水相比，食鹽溶液對VC分解影響不大；茶水對VC的散失具有較弱的加速作用，這是因為茶水雖然含有茶堿、咖啡堿、生物堿和膽堿等弱堿物質(zhì)，但是也含有茶多酚等弱酸性物質(zhì)，在這些物質(zhì)的綜合作用下茶水顯很弱的堿性；蔗糖溶液對VC分解具有很大加速作用，可能是由于蔗糖是一種還原糖，它會與VC氧化產(chǎn)生的脫氫抗壞血酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)而被大量消耗的緣故(邱紫云等，2015)。

3 結(jié)論

建立了橘子中VC的HPLC測定方法，經(jīng)方法學(xué)考察表明，該方法具有檢出限低、精密度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可為橘子中VC含量的檢測提供科學(xué)的分析方法。利用該方法，對VC標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，VC濃度在0.10～6.00 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=33 032x+3 233.3，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6，RSD為1.424%，LOD為0.087 mg/L；市售橘子中VC的穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示，VC在低溫和避光條件下比較穩(wěn)定，在堿性介質(zhì)中易被破壞，在酸性介質(zhì)中較為穩(wěn)定，在鹽溶液中影響不大，而蔗糖溶液對VC的分解具有很大的加速作用，VC的分解呈現(xiàn)一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律。