卵形鯧鲹 SST1基因的克隆與組織表達

黃 姻，馮鵬霏，潘傳燕，余艷玲，武 霞，杜雪松，張永德，羅洪林

(1.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，南寧 530021；2.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林 541006)

生長激素(Growth hormone,GH)是脊椎動物主要的生長調(diào)節(jié)因子，受多種激素的調(diào)控，通過其受體GHR作用于靶組織，或通過刺激肝臟產(chǎn)生胰島素樣生長因子(Insulin like growth factor,IGF)間接發(fā)揮作用[1]。在控制GH釋放的眾多激素中，生長抑素(Somatostatin,SS)是最直接有效的抑制劑[2]。SS是一個多肽激素家族，不僅可以直接抑制GH和IGF-1的合成與分泌，還可以通過降低對GH與IGF-1結(jié)合的敏感性，并以垂體外的方式影響GH-IGF-1系統(tǒng)[3-4]，在動物的生長、發(fā)育和代謝等許多方面發(fā)揮重要的作用[5-6]。SS主要通過與靶細胞表面的特異性受體(Somatostatin receptor,SST)結(jié)合而發(fā)揮抑制GH分泌的作用[7]。SST是一種跨膜受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)超家族，在動物體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7個SST(SST1～SST7)，但目前在硬骨魚中尚未鑒定到SST4[8-9]。SST分布在機體多個系統(tǒng)和組織器官中，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸道、垂體、腎臟、甲狀腺、肺、免疫細胞和各種癌細胞[10-11]。每個SST都具有亞型選擇性、組織特異性和種屬特異性的分布模式，參與細胞內(nèi)不同信號傳導(dǎo)的激活過程。研究表明，SST1可影響體質(zhì)量并導(dǎo)致生長遲緩[12]，還可以影響形態(tài)性狀的發(fā)育，包括體長、體高和胸圍等[13]。

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)是中國名貴的海水養(yǎng)殖魚類，也是適合中國近、遠海集約化養(yǎng)殖的重要品種之一，它具有生長快、適應(yīng)性強等優(yōu)良的生物學(xué)特性，其人工養(yǎng)殖近年來在中國南部沿海地區(qū)得到迅速發(fā)展[14]，已成為中國農(nóng)業(yè)部推薦的9種海水養(yǎng)殖品種之一。然而，由于育種工作的滯后，導(dǎo)致卵形鯧鲹出現(xiàn)明顯的種質(zhì)退化現(xiàn)象，種群遺傳多樣性面臨較高的丟失風(fēng)險[15]，因此，開展卵形鯧鲹生長發(fā)育相關(guān)功能基因的研究，對促進卵形鯧鲹種質(zhì)資源的開發(fā)利用及其產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展意義重大。SST1基因的表達與動物生長發(fā)育和形體性狀顯著相關(guān)，可作為研究生長相關(guān)的候選基因之一。本研究克隆卵形鯧鲹的SST1基因，并對其所表達的受體蛋白進行生物信息學(xué)分析，預(yù)測其可能的生物學(xué)功能，采用熒光定量PCR的方法對SST1基因在卵形鯧鲹不同胚胎發(fā)育時期及其幼魚不同組織中的分布和表達進行定量分析，旨在為進一步研究卵形鯧鲹SST1及SS基因在其生長發(fā)育過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

卵形鯧鲹取自深圳市南澳鎮(zhèn)大鵬灣海域人工養(yǎng)殖群體，對卵形鯧鲹進行人工繁育[16]，采集其胚胎發(fā)育的受精卵期、4細胞期、16細胞期、多細胞期、高囊胚期、原腸早期、原腸中期、原腸末期、胚體形成期、眼囊期、耳囊期、心臟跳動期、晶體出現(xiàn)期、初孵仔期共14個不同時期組織樣品各50～100 mg，每個時期3個生物學(xué)重復(fù)。另取雌雄各3尾，體質(zhì)量為523～586 g的卵形鯧鲹幼魚，經(jīng)MS222麻醉致死后，分別剖取其背鰭、皮膚、肌肉、眼睛、腮、腦、心臟、肝臟、脾臟、頭腎、精巢、卵巢、胃、腸共14個組織樣品各50～100 mg，每個組織雌雄各3個生物學(xué)重復(fù)。樣品經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱保存，用于SST1組織表達研究。

1.2 方 法

1.2.1SST1基因的生物信息學(xué)分析 登錄BioProjec(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject)，從卵形鯧鲹的基因組(登錄號：PRJNA574895)中找到SST1基因序列(ID：EVM0001630)，利用NCBI BLAST對卵形鯧鲹與其他物種的SST1基因序列(表1)進行同源比對分析，下載與卵形鯧鲹相近的18種魚類的SST1基因序列，采用Mega X軟件對卵形鯧鲹與這18種近緣魚類的SST1基因序列進行多重比對，計算遺傳距離，采用Poisson模型，對空位采用完全刪除(Complete deletion)，并用“bootstrap”1 000次自舉檢測各分支的置信度，構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹，采用Evolview 3.0對進化樹進行美化。

表1 19種魚類的 SST1基因信息Table 1 SST1 gene information of 19 fish species

參考有關(guān)文獻中的相關(guān)方法[17-18]，利用NCBI的ORF finder對卵形鯧鲹的SST1基因序列進行開放閱讀框及其所編碼的氨基酸序列進行預(yù)測分析；采用Protparam分析基因所表達SST1蛋白的理化特性；DNASTAR 7.1分析SST1蛋白的親水性、抗原指數(shù)，NetSurfP預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，Phyre2同源構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)模型，并用SAVES 5.0軟件對構(gòu)建的模型進行評估；TMHMM分析其跨膜結(jié)構(gòu)；采用SignalP分析其信號肽，采用NetPhos 2.0分析其磷酸化位點，PSORT預(yù)測其亞細胞定位。在線分析軟件的分析內(nèi)容與網(wǎng)址信息見表2。

表2 SST1基因在線分析軟件信息Table 2 Information of online analysis software for SST1 gene

1.2.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照RNA提取試劑盒[天根生物科技(北京)有限公司]的操作說明，分別提取卵形鯧鲹14個胚胎發(fā)育時期組織樣品和幼魚14個臟器組織樣品的總RNA，采用NanoDrop One檢測RNA質(zhì)量濃度，通過20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整度。再根據(jù)Hiscript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA第一鏈。

1.2.3 卵形鯧鲹SST1基因的表達分析 以18S rRNA為內(nèi)參基因[19]，根據(jù)卵形鯧鲹SST1基因序列設(shè)計熒光定量PCR引物(SST1-F：5′-GGTCCCTGATGTGTCGGTTGG-3′；SST1-R：5′-ACAGTGGGTCTGCGGTAGCG-3′)，以卵形鯧鲹14個不同胚胎發(fā)育時期和幼魚14個組織的cDNA為模板進行熒光定量PCR擴增。反應(yīng)體系為15 μL，其中7.5 μL的ChamQ SYBR qPCR Mix，上下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，cDNA模板1.2 μL，5.7 μL的ddH2O，每個樣品3個重復(fù)。SST1基因的表達量采用相對Ct法(2-△△Ct)進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 統(tǒng)計分析SST1基因在卵形鯧鲹14個不同胚胎發(fā)育時期和幼魚14個組織中的表達量結(jié)果用 “平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，運用統(tǒng)計學(xué)軟件IBM SPSS Statistics 19.0對結(jié)果進行相對獨立的單因素方差分析(ANOVA)，利用Duncan’s多重比較分析各組織間的差異顯著性，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SST1基因的生物學(xué)信息

2.1.1SST1同源性及進化分析 將卵形鯧鲹SST1基因的氨基酸序列與同科近緣魚類黃尾鰤(XM_023423827)和高體鰤(XM_022747791.1)進行序列比對，序列相似度為92.38%和 91.87%，確定該序列為卵形鯧鲹的SST1基因序列。利用卵形鯧鲹SST1基因與其他18種魚類的SST1基因比對分析，構(gòu)建ML系統(tǒng)進化樹(圖1)。所分析的魚類主要聚成3支，其中一支為鱸形目(Perciformes)魚類，包括南極魚亞目(Notothenioidei)、杜父魚亞目(Cottioidei)、鮨亞目(Serranoidei)魚類；第二支主要由雀鯛科(Pomacentridae)、金鱗魚科(Holocentridae)、攀鱸目(Anabantiformes)、蟾魚科(Batrachoididae)等魚類聚合而成；第三支主要由鲹形目(Carangiformes)、蝦虎魚目(Gobiiformes)等魚類聚合而成。其中卵形鯧鲹、黃尾鰤與高體鰤均屬于鲹科(Carangidae)魚類，具有較近的遺傳距離，而魚印魚(Echeneis naucrates)為魚印科(Echeneidae)魚類，遺傳距離則稍遠。

2.1.2SST1基因的序列基本結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 卵形鯧鲹SST1基因的cDNA序列長度為1 155 bp(圖2)，序列中A、C、G、T含量分別為20.78%(240個)、26.58%(307個)、25.89%(299個)和26.75%(309個)，GC含量(52.48%)高于AT含量(47.53%)，說明編碼區(qū)的DNA雙鏈較為穩(wěn)定。卵形鯧鲹SST1基因序列的開放閱讀框為1 104 bp，編碼368個氨基酸，其包含7 TM_GPCR_Srx結(jié)構(gòu)域。所編碼的蛋白分子質(zhì)量為41.42 ku，理論等電點為8.47，為堿性蛋白。帶負電荷的殘基總數(shù)(Asp + Glu)為26，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg + Lys)為31，說明SST1所編碼的蛋白為帶正電的蛋白。蛋白不穩(wěn)定性指數(shù)(Ⅱ)為39.82，說明該蛋白為較穩(wěn)定的蛋白。

卵形鯧鲹SST1基因編碼的蛋白平均親水系數(shù)(GRAVY)為0.539，說明該蛋白為疏水性蛋白。序列中含有較多的疏水性氨基酸，疏水性區(qū)段主要集中于34～63、70～95、103～134、152～175、195～226、246～271、279～289、311～318位氨基酸(圖3)。疏水性氨基酸中色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe、纈氨酸Val、亮氨酸Leu、異亮氨酸Ile、丙氨酸Ala和甲硫氨酸Met分別占編碼氨基酸的1.90%、5.71%、11.14%、10.60%、6.79%、8.15%和3.50%。跨膜區(qū)分析結(jié)果(圖4)顯示，SST1蛋白存在7個跨膜結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域的位置為36～58、71～93、108～130、151～173、198～220、247～269、279～301。

2.1.3SST1基因編碼蛋白的抗原性及亞細胞定位分析 采用Protean中的Jameson-Wolf方法預(yù)測卵形鯧鲹SST1蛋白的抗原指數(shù)，了解其可能的抗原表位位點。由圖5可看出，其抗原指數(shù)較高的區(qū)段為第22～35、64～68、141～150、176～185、234～245、272～278、301～310、318～328、333～339、341～351、354～362位氨基酸。SST1蛋白全長序列中潛在的抗原表位相對不是很豐富，且相對較集中在序列的尾端。對SST1亞細胞定位進行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)其主要定位于細胞質(zhì)膜，推測其在細胞膜發(fā)揮作用。

2.1.4SST1基因編碼蛋白的信號肽及磷酸化位點分析 采用Signal P對SST1蛋白進行預(yù)測分析，未發(fā)現(xiàn)信號肽位點(圖6)。磷酸化位點預(yù)測結(jié)果(圖7)顯示，絲氨酸磷酸化位點有4個，主要位于240、308、320、341位點；蘇氨酸磷酸化位點5個，主要位于149、339、362、366、367位點；酪氨酸磷酸化位點8個，主要位于9、24、27、28、58、133、329、361位點。這17個磷酸化位點的可信度均為0.70以上，說明其可信度較高。

2.1.5 SST1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用NetSurfP對SST1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行在線預(yù)測，結(jié)果如圖8所示，SST1蛋白二級結(jié)構(gòu)主要包含α-螺旋(Alpha helix)、延伸鏈(Extended strand)及無規(guī)則卷曲(Random coil)3 種類型，其中α-螺旋氨基酸有150個，占總數(shù)的40.76%、延伸鏈氨基酸60個，占總數(shù)的16.13%、無規(guī)則卷曲氨基酸149個，占總數(shù)的40.49%。

利用Phyre 2對SST1蛋白進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，構(gòu)建SST1三維結(jié)構(gòu)模型，同源建模的模板序列與SST1序列的一致度為43%，模型的可信度為100%。SST1蛋白三維結(jié)構(gòu)(圖9-a)顯示，其主體結(jié)構(gòu)為由7段α-螺旋并列扭曲排列成一柱狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)也是跨膜區(qū)的主要結(jié)構(gòu)，柱狀結(jié)構(gòu)的一端連接一個由4個α-螺旋排列成的小短柱狀結(jié)構(gòu)，位于胞外(圖9-b)。采用SAVES在線程序?qū)?gòu)建的SST1蛋白模型進行評估，結(jié)果顯示，77.70%的殘基平均3D-1D得分≥ 0.2，ERRAT質(zhì)量評分為100，Procheck 9項評估中，通過4項，警告5項，無錯誤項，說明構(gòu)建的模型可靠性較高。

2.2 SST1基因在卵形鯧鲹不同胚胎發(fā)育時期的表達分析

SST1基因在卵形鯧鲹胚胎發(fā)育的14個關(guān)鍵時期均有表達，結(jié)果見圖10。由圖可知，從受精卵期到晶體出現(xiàn)期SST1基因都是低表達；進入初孵仔期SST1基因表達量開始急劇增加，極顯著高于此前的各個胚胎發(fā)育時期(P<0.01)。

2.3 SST1基因在卵形鯧鲹幼魚不同組織中的表達分析

對卵形鯧鲹幼魚的14個組織進行SST1表達量檢測，結(jié)果見圖11，SST1基因在卵形鯧鲹腦組織中呈現(xiàn)高度的表達，其表達量極顯著高于其他13個組織(P<0.01)，其次是在卵巢中也呈現(xiàn)高度的表達，其表達量極顯著高于另外12個組織(P<0.01)，在精巢中的表達量低于卵巢，但顯著高于皮膚組織(P<0.05)，極顯著高于其他10個組織(P<0.01)，皮膚組織的表達量相對較低，但顯著高于其他10個組織(P<0.05)。肌肉、心、肝等10個組織的表達量極低，其組間差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

SST1作為SS其中的一個特異性受體，介導(dǎo)了SS在動物生長發(fā)育過程中所發(fā)揮的負調(diào)控作用[20]。目前，SST1基因在赤點石斑魚(Epinephelusakaara)[21]、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[22]、線翎電鰻(Apteronotusalbifrons)[23]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[24]等魚類中已被鑒定或克隆。本研究結(jié)果表明，卵形鯧鲹SST1基因開放閱讀框1104 bp，編碼368個氨基酸，與赤點石斑魚[21]384個氨基酸大小接近，蛋白分子質(zhì)量為41.42 ku，帶正電荷，理論等電點為8.47，屬于堿性蛋白，且蛋白較穩(wěn)定。亞細胞定位與跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，蛋白主要定位于細胞質(zhì)膜，存在7個跨膜結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)顯示，其主體結(jié)構(gòu)是由7段α-螺旋并列扭曲排列成一柱狀結(jié)構(gòu)，位于跨膜區(qū)，這與SST1屬于GPCRs超家族，而GPCRs由7個跨膜受體結(jié)構(gòu)域組成結(jié)果一致[25]。

磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Protein post-translational modifcation,PTM)中最常見的類型，在真核生物的幾乎所有細胞過程中都發(fā)揮重要的作用[26]。蛋白的磷酸化是在蛋白質(zhì)上引入帶負電的磷酸基團，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能活性發(fā)生變化，大多數(shù)磷酸化發(fā)生在蛋白質(zhì)的絲氨酸殘基上，蘇氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化作用不如絲氨酸殘基的磷酸化[27]。蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)細胞的多種生物過程，如基因表達、代謝、細胞周期調(diào)節(jié)、分化和凋亡等[28-29]。據(jù)估計，大約30%的人類蛋白質(zhì)在其生命周期的某個時刻被磷酸化[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，卵形鯧鲹SST1蛋白具有17個磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點有4個，主要位于蛋白的第3細胞內(nèi)環(huán)和C-端，定位于細胞內(nèi)。蘇氨酸磷酸化位點有5個，主要位于蛋白的第2細胞內(nèi)環(huán)和C-端，定位于細胞內(nèi)；酪氨酸磷酸化位點有8個，主要位于蛋白的N-端、第1、2細胞內(nèi)環(huán)和C-端，定位于細胞外和細胞內(nèi)，而對于SST來說，第3細胞內(nèi)環(huán)和C-端潛在磷酸化位點對磷酸化、內(nèi)化和脫敏非常重要[30-31]。預(yù)測結(jié)果顯示，卵形鯧鲹SST1蛋白存在較多的磷酸化位點，推測該蛋白存在磷酸化現(xiàn)象，但需通過質(zhì)譜分析等方法進一步研究。

系統(tǒng)發(fā)育樹為研究物種起源及其分子進化，進而探索基因功能提供了依據(jù)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明SST家族可聚為2個大分支和7個主要分支，其中一個大分支包含SST2、3、5和7，另一個包含SST1、4和6，SST1和SST4彼此密切相關(guān)，SST6型存在于許多魚類中，但在四足動物和鳥類中不存在[9]，而在人類、其他四足動物和鳥類中存在的SST4型似乎在所有被調(diào)查的硬骨魚類基因組中都缺失[32-33]。本研究對卵形鯧鲹與其他18種魚類SST1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，系統(tǒng)發(fā)育樹有3個主要分支，其中一支由鱸形目(Perciformes)7種魚類組成，第二支主要由雀鯛科(Pomacentridae)、金鱗魚科(Holocentridae)、攀鱸目(Anabantiformes)與蟾魚科(Batrachoididae)等6種魚類聚合而成；第三支主要由鲹形目(Carangiformes)、蝦虎魚目(Gobiiformes)等6種魚類聚合而成，其中卵形鯧鲹、黃尾鰤與高體鰤均屬于鲹科(Carangidae)魚類，顯示了較近的遺傳距離。SST1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹代表了這些物種SST1基因的進化關(guān)系，但與這些物種的系統(tǒng)分類學(xué)存在較高的一致性。

SS與SST廣泛存在于魚類發(fā)育的不同時期以及各個組織中。SST的表達直接影響著SS對GH分泌的雙向調(diào)節(jié)作用[34]。本研究發(fā)現(xiàn)SST1在卵形鯧鲹的初孵仔期之前的受精卵期、4細胞期、16細胞期、多細胞期、高囊胚期、原腸早期、原腸中期、原腸末期、胚體形成期、眼囊期、耳囊期、心臟跳動期和晶體出現(xiàn)期這13個胚胎發(fā)育時期都是微量的低表達，直到初孵仔期表達量迅速升高。這一結(jié)果與生長抑素前體(PreprosomatostatinⅠ,PPSⅠ)的mRNA在大西洋鱈魚(Gadus morhua)胚胎發(fā)育過程中的表達量變化趨勢一致[35]。說明SS高表達能抑制GH的分泌，低表達卻能促進GH的分泌促進細胞增殖和分化，而SS與SST基因的表達受胚胎發(fā)育過程以及動物的營養(yǎng)狀況有關(guān)。

雖然SST的基因分布存在重疊現(xiàn)象，但卻具有明顯的表達模式特異性，SST作用機制存在組織特異性應(yīng)答[36]。本研究通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，SST1在卵形鯧鲹不同組織中的表達量差異極顯著，其中在腦部組織中顯著高度表達，其次是卵巢和精巢，而在其他10個組織中的表達量則較低。Slagter等[24]對虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的研究發(fā)現(xiàn)，SST1在腦、胃、胰腺和腎臟中高表達，而Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)赤點石斑魚SST1在20個組織中廣泛表達，并且在每個組織中的表達水平非常相似。上述研究說明SST1可能介導(dǎo)了卵形鯧鲹的多種生理功能，其表達分布可能存在組織特異性和種屬特異性，不同種屬的SST1基因表達模式的差異，表明其在調(diào)節(jié)不同的生理過程中可能存在功能差異。

大腦和垂體表達多種神經(jīng)肽，如GH、促性腺激素釋放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成激素(LH)、催乳素(PRL)和睪酮(testosterone,Ts)等[37]，它們共同調(diào)控動物的生長和繁殖，并且SST也參與了這些過程[4,38]。本研究結(jié)果顯示卵形鯧鲹腦部SST1高表達，說明SST1可能參與了神經(jīng)內(nèi)分泌活動。卵巢中SST1的高表達表明它可能參與生殖激素的調(diào)節(jié)，在雌性性腺發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

總之，SST1在卵形鯧鲹發(fā)育的不同時期和不同組織中均有表達，其中，在初孵仔期呈現(xiàn)高表達以抑制GH的分泌，在其他時期則呈現(xiàn)低表達，更有利于GH分泌促進細胞的增殖分化與機體發(fā)育；在腦組織中表達量最高，其次是卵巢和精巢，表明SST1可能在神經(jīng)內(nèi)分泌、雌性性腺發(fā)育及精子發(fā)生過程中都發(fā)揮著重要作用。