高效液相色譜法測定發(fā)酵制品中苯乳酸和苯丙酮酸

◆作者：侯楠楠 謝全喜 王 梅 王 倩 鹿曉慧 周 紅 谷 巍

◆單位：山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室

苯乳酸也稱3-苯乳酸或β-苯乳酸，是一種安全無毒新型天然廣譜生物防腐劑，其分子式為C9H10O3，相對分子質量為166（Alistair L Wilkins，2015）。研究發(fā)現(xiàn)，苯乳酸能夠抑制多種細菌和真菌的生長，具有較好的溶解性和穩(wěn)定性，可用作食源性防腐劑。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)的干酪在成熟過程中產(chǎn)生苯乳酸對食源致病菌具有很強的抑制作用（Dieuleveux V，1998）；同時研究學者進一步確定苯乳酸的廣譜抑菌效果（Lavermicocca P，2000）。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，苯乳酸是丹參的一種衍生物，可應用于醫(yī)藥行業(yè)，抑制溶血空斑的形成，增強機體抗氧化能力等（李艷杰，2012）。因此苯乳酸無論是在生物防腐還是醫(yī)藥領域都有非常重要的應用價值。目前合成方法主要有化學合成法和生物合成法。其中化學合成存在許多不足，比如技術條件復雜、反應條件嚴苛、環(huán)境污染比較大等；生物合成苯乳酸是一種新方法，具有環(huán)境友好，副產(chǎn)物少的特點（鄧林，2014）。研究發(fā)現(xiàn)許多微生物發(fā)酵都可以產(chǎn)生苯乳酸（李興峰，2011；Shuhuai，2014）。

單純依靠菌株自身產(chǎn)苯乳酸，能力有限，通過誘變菌株、改良培養(yǎng)基或是添加底物的方法可以提高苯乳酸的產(chǎn)量。添加底物主要有苯丙氨酸和苯丙酮酸，李興峰等（2011）研究發(fā)現(xiàn)：在乳酸菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的過程中，轉氨反應是限速步驟，成為苯乳酸產(chǎn)生的瓶頸，可以采用苯丙酮酸代替苯丙氨酸作為底物合成苯乳酸，因此苯丙酮酸作為底物來提高苯乳酸的產(chǎn)量成為研究熱點。但如何同時評價發(fā)酵制品中苯乳酸及苯丙酮酸的含量成為研究的難題。因此，開發(fā)一種快速分離檢測苯乳酸與苯丙酮酸的檢測方法是必不可少的。國內(nèi)外對苯乳酸及苯丙氨酸的分析方法，主要還是薄層層析、氣相色譜、液相色譜等，但同時對兩種成分進行檢測分析的方法在國內(nèi)外未見報道。本研究通過對液相檢測條件的摸索優(yōu)化，成功開發(fā)出一種能夠同時檢測分析苯乳酸與苯丙酮酸的檢測方法，在提高靈敏度及分離度的前提下，減少了分析時間，節(jié)省溶劑用量，節(jié)約成本。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設備

三氟乙酸和甲醇（均為色譜級）：天津市永大化學試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：青島海博生物技術有限公司；苯丙酮酸標準品（分析純，純度≥99.5%）、DL-3苯乳酸標準品（分析純，純度≥98%）：美國Sigma公司。

微孔濾膜（直徑13 mm、孔徑0.22μm），LC-20A液相色譜儀，InertSustain AQ-C18 5μm 4.6×250mm（W）色譜柱，AL204電子分析天平，GL21M高速冷凍離心機，超純水凈化系統(tǒng)（超純水儀）CLDC271509，雷磁精密酸堿度計PHS-3C，超聲波清洗機SB120D。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥品及試劑配制

標準溶液的配制：分別準確稱取DL-3苯乳酸標準品0.2058 g（實含苯乳酸0.2048 g）、苯丙酮酸標準品0.2143 g（實含苯丙酮酸0.21 g），用超純水溶解后定容至100 mL，配制成2.048 g/L的苯乳酸標準溶液和2.100 g/L的苯丙酮酸標準溶液。然后從中分別 吸 取0.625 mL、1.25 mL、2.5mL和5.0 mL用超純水定容至10.0 mL，各組質量濃度如表1。流動相A（0.05%三氟乙酸水溶液）：0.5 mL三氟乙酸加水定容至1 L；流動相B（0.05%三氟乙酸甲醇溶液）：0.5 mL三氟乙酸加甲醇定容至1 L。

表1 混合標準溶液濃度梯度組成 單位：g/L

1.2.2 色譜條件

HPLC法測定苯乳酸/苯丙酮酸含量，色譜條件為色譜柱：InertSustain AQ-C18 5μm 4.6×250mm（W），柱溫箱：30℃，進樣量：20μL，流速：1.0 mL/min。流動相A：0.05%三氟乙酸水溶液，流動相B：0.05%三氟乙酸甲醇溶液；梯度洗脫條件：0-15min流動相B的比例由40%升至80%，15-16min流動相B的比例保持80%，16-18min流動相B的比例由80%降至40%，洗脫完成。檢測波長210 nm。

1.2.3 樣品的制備與提純

乳酸菌發(fā)酵液制備：將超低溫冰箱（-80℃）保存的乳酸菌菌株 BLCC2-0011、BLCC2-0021、BLCC2-0024、BLCC2-0026、BLCC2-0038、BLCC2-0069、BLCC2-0323、BLCC2-0327 和BLCC2-0410凍干粉分別接種于MRS固體斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)好的菌株，在無菌條件下用接種環(huán)挑取一環(huán)接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，經(jīng)10000r/min，離心5min，取發(fā)酵上清液經(jīng)0.22μm濾膜兩次過濾后，作為待測樣品，采用高效液相色譜法測定苯乳酸/苯丙酮酸含量。

固體樣品：使用乳酸菌菌株BLCC2-0021發(fā)酵液2%添加，苯丙酮酸0.15%添加，發(fā)酵豆粕（料水比100∶45），37℃發(fā)酵3天，準確稱取5.000 g發(fā)酵料樣品加入加無水甲醇10 mL，將樣品混合均勻后4℃靜止4 h，超聲提取30 min，混勻后經(jīng)4000 r/min離心5 min，取上清至20 mL刻度試管，再加無水甲醇10 mL，混勻后經(jīng)4000 r/min離心5 min，取上清至20 mL刻度試管，定容至20 mL。取定容好的上清液10000 r/min，離心5 min取上清，經(jīng)0.22μm濾膜兩次過濾后作為待測樣品，采用高效液相色譜法測定苯乳酸/苯丙酮酸含量。

1.2.4 定性與定量分析

定性分析：利用上述色譜條件分別檢測苯乳酸標準品溶液、苯丙酮酸標準品溶液、處理完的樣品溶液，確定樣品中是否含有苯乳酸或苯丙氨酸。

定量分析：將上述1.2.1中配制的標準溶液利用上述色譜條件分別進樣分析，以峰面積和濃度作圖，得到苯乳酸或苯丙酮酸標準曲線回歸方程，根據(jù)峰面積帶入公式自動計算樣品中各組分的含量。

1.2.5 樣品回收率測定

通過在同一發(fā)酵液中加入不同濃度標準品混合液，測定該方法的回收率（張建玲，2020）。

1.2.6 樣品精密度測定

通過對同一發(fā)酵料重復檢測5次，測定該方法的精密度。

2 結果與分析

表2 不同菌株發(fā)酵24 h苯乳酸、苯丙酮酸產(chǎn)量統(tǒng)計

2.1 色譜分離

按1.2.2所述色譜條件，將苯乳酸標準液、苯丙酮酸標準液和混合標準液分別多次進樣分析，確定樣品保留時間，苯乳酸標準品的HPLC色譜圖（圖1，苯乳酸標準品濃度2.048 g/L），可以看出，在10.709 min左右出現(xiàn)苯乳酸色譜峰，且穩(wěn)定性良好、分離效果好、峰型理想、靈敏度高；苯丙酮酸標準品的HPLC色譜圖（圖2）可以看出，在10.034 min左右出現(xiàn)苯丙酮酸色譜峰，且穩(wěn)定性良好、分離效果好、峰型理想；苯乳酸和苯丙酮酸標準品混標的HPLC色譜圖（圖3）可以看出，在10.034 min左右出現(xiàn)苯丙酮酸色譜峰，在10.709 min左右出現(xiàn)苯乳酸色譜峰，分離效果好，峰型理想。

圖1 苯乳酸標準品色譜圖

圖2 苯丙酮酸標準品色譜圖

圖3 苯乳酸和苯丙酮酸混標色譜圖

國內(nèi)外有關苯乳酸檢測的報道比較多（黃國昌，2016；朱育菁，2015；寧亞維，2021），本實驗采用日本島津公司LC-20A紫外檢測器，在激發(fā)波長210、254、340 nm分別檢測同一樣品，發(fā)現(xiàn)210 nm條件下檢測干擾少、雜峰少，檢測效果最佳，最終確定檢測波長為210 nm。流動相的優(yōu)化，流動相A：0.05%三氟乙酸水溶液，流動相B：0.05%三氟乙酸甲醇溶液，少量的三氟乙酸可以與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，起到改善峰形、克服峰展寬和拖尾問題；梯度洗脫流動相A和B比例的調整，初始流動相B的比例從20%調整到40%時，可以有效避免目標峰的重疊，將苯乳酸與丙苯酮酸分離開。

2.2 標準曲線

以苯乳酸/苯丙氨酸的色譜峰面積（A）對應進樣的質量濃度（C，g/L）作圖，得到標準曲線如圖4、圖5。苯乳酸的線性回歸方程為C=0.00000002151A-0.1092（R2=0.9955），苯丙酮酸的線性回歸方程為

圖4 苯乳酸標準曲線

圖5 -苯丙酮酸標準曲線

2.3 定性與定量分析

發(fā)酵液中苯乳酸及苯丙酮酸的檢測如圖3所示，目標峰與其他峰分離效果較好，利用該方法可以有效分析發(fā)酵液中苯乳酸及苯丙酮酸。根據(jù)文獻報告多數(shù)乳酸菌可以產(chǎn)生苯乳酸，本實驗中共檢測了10株乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的含量，發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵液中苯乳酸的產(chǎn)量在0.1～1.1 g/L不等。這一結果與張雯等之前研究發(fā)現(xiàn)酸奶、泡菜等乳酸菌發(fā)酵食品中檢測出苯乳酸的結果不謀而合，歸結起來應該是乳酸菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生苯乳酸（張雯，2020；吳仁蔚，2020）。

關于液體樣品的提取，試驗中還分別對比了4000 r/min和10000 r/min離心同一樣品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)10000 r/min離心過的樣品雜峰更少，因此選擇液體樣品10000 r/min離心的處理方式。關于固體樣品苯乳酸檢測的前處理方法有很多（鄧林，2014），因為苯乳酸微溶于水，提取溶劑一般選擇甲醇，比較了甲醇溶解直接檢測和甲醇溶解后4℃靜止4 h，超聲30 min的效果，發(fā)現(xiàn)后者苯乳酸提取率相對更高。

2.4 回收率與精密度

上述發(fā)酵液加標后，分別統(tǒng)計苯乳酸及苯丙酮酸的含量，計算苯乳酸/苯丙酮酸的加標回收率，統(tǒng)計結果如表3所示。

表3 BLLC2-0021發(fā)酵液加標后檢測結果統(tǒng)計

將上述發(fā)酵料重復5次進樣，檢測每次發(fā)酵料中苯乳酸和苯丙酮酸的含量，檢測結果表4所示。結果表明，苯乳酸的回收率、標準偏差分別是100.79%、2.62%；苯丙酮酸的回收率、標準偏差分別是99.12%、0.86%；該方法可靠，重復性好，符合國家標準。

表4 BLLC2-0021發(fā)酵料重復進樣結果統(tǒng)計

3 結論

本研究通過使用甲醇提取發(fā)酵制品中苯乳酸及苯丙酮酸，建立了一種同時檢測發(fā)酵液及發(fā)酵制品中苯乳酸和苯丙酮酸的檢測方法，與傳統(tǒng)檢測方法相比，該方法更加簡單、準確、且分離效果比較好，10.709 min左右出現(xiàn)苯乳酸色譜峰，10.034 min左右出現(xiàn)苯丙酮酸色譜峰。本研究建立起來的方法可以滿足發(fā)酵工藝中防腐物質苯乳酸的檢測，以及工藝升級苯丙酮酸殘余量的檢測。

參考文獻：（略）