檸檬醛對(duì)中藥材黃曲霉菌的抑制研究

夏詩(shī)琪，賈全全，王培玲，胡小紅，朱靈芝，朱培林*，王宗德

（1. 江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330032；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院/國(guó)家林草局木本香料（華東）工程技術(shù)研究中心/國(guó)家林草局江西省樟樹(shù)工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330045）

【研究意義】我國(guó)是中藥材種植大國(guó)，中藥材從采收到使用往往儲(chǔ)藏?cái)?shù)月至數(shù)年，期間會(huì)因?yàn)榭諝鉂穸?、溫度等外界因素的影響，使中藥材發(fā)生霉變[1]。黃曲霉菌是能引起藥材霉變的優(yōu)勢(shì)菌種，中藥材感染黃曲霉菌不僅導(dǎo)致中藥材中有效成分的降低，影響中藥材品質(zhì)，而且存在食用安全隱患[2]。黃曲霉菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素B1具有強(qiáng)致癌性[3]。目前，研究人員更多關(guān)注的是感染黃曲霉毒素的花生、玉米、大米等糧食作物，并開(kāi)展了黃曲霉菌的分離鑒定、產(chǎn)毒力研究和防控等方面的研究[4-6]。然而，近年來(lái)，中藥材中黃曲霉毒素超標(biāo)事件頻發(fā)，中藥材黃曲霉菌的分離分析和防治具有非常重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】中藥材儲(chǔ)藏往往采用干燥法、低溫冷藏法、硫磺熏蒸等簡(jiǎn)單傳統(tǒng)的手段來(lái)控制霉變[7]，該類方法缺乏長(zhǎng)效性，還可能造成化學(xué)試劑殘留，危害健康[8]。天然植物的某些次生代謝產(chǎn)物如植物精油具有廣譜抑菌活性，可開(kāi)發(fā)成防霉劑使用，已成為目前綠色防霉的研究熱點(diǎn)[9-10]。【本研究切入點(diǎn)】山蒼子是江西特色樹(shù)種，資源豐富。大量研究表明山蒼子精油中的主成分檸檬醛對(duì)植物病原菌[11]、食源性致病菌[12]、木腐真菌[13]有廣譜高效的抑制作用。檸檬醛防治黃曲霉菌的研究較少，大部分僅僅以標(biāo)準(zhǔn)模式菌株作為研究對(duì)象，結(jié)果缺乏說(shuō)服力[14]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】擬從霉變藥材中分離鑒定黃曲霉菌，比較分析檸檬醛對(duì)源自中藥材的黃曲霉菌的體外抑菌效果，并將分離得到的黃曲霉菌接種到藥材中，研究檸檬醛的實(shí)際防霉效果，為天然檸檬醛防霉劑的開(kāi)發(fā)和中藥材黃曲霉菌的防控提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)耗材與設(shè)備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），青島海博生物技術(shù)有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB），氯仿，異戊烷，醋酸鉀，異丙醇，乙醇，TE緩沖液均為分析純，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酶mix混合劑，湖南擎科生物技術(shù)有限公司；ITS1引物5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′和ITS4引物5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′，廈門寶誠(chéng)生物科技有限公司；天然檸檬醛（>96%），江西麻山化工有限公司；黃曲霉菌CGMCC 3.4408，中國(guó)工業(yè)微生物菌種管理保藏中心。

恒溫培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；顯微鏡，上海光學(xué)儀器六廠；離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；T100 PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1黃曲霉菌分離純化收集霉變中藥材（澤瀉、枳殼等），用無(wú)菌水將霉變藥材上的疑似霉菌洗脫，用點(diǎn)樣法將洗脫下來(lái)的水點(diǎn)到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1～2 d，將長(zhǎng)出的單菌落接到新的培養(yǎng)皿中，若不純則需多次反復(fù)純化。

1.2.2形態(tài)學(xué)鑒定純菌落培養(yǎng)出來(lái)后，挑取少量菌絲在顯微鏡下觀察其微觀形態(tài)。

1.2.3分子學(xué)鑒定（1）DNA提取。1）從培養(yǎng)皿上刮取適量菌絲，加入60 ℃預(yù)熱的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）進(jìn)行研磨。研磨后將研磨液轉(zhuǎn)移到離心管中，60 ℃水浴保溫30～60 min。2）加入適量氯仿/異戊醇（24﹕1）溶液，混合均勻，11 400 r/min離心15 min。3）收集上清液，加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），混合均勻，11 400 r/min離心15 min。4）重復(fù)步驟3。5）收集上清液，加入10%總體積的5 mol/L醋酸鉀溶液，加入2/3總體積的異丙醇，混勻靜置，冷凍過(guò)夜。6）出現(xiàn)沉淀后，11 400 r/min離心5 min。7）棄去液相，加入400 μL 70%乙醇，震蕩洗滌，11 400 r/min離心5 min。8）重復(fù)步驟7。9）棄去液相，DNA干燥后加入50～100 μL TE緩沖液，于37 ℃下溶解DNA后在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）擴(kuò)增。向提取的DNA中依次加入9.5 μL 雙蒸水、12.5 μL酶mix混合劑，1 μL ITS1正向引物，1 μL ITS4反向引物，1 μL模板DNA，于PCR儀上擴(kuò)增。ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）為引物擴(kuò)增ITS序列。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京博邁德生物有限公司測(cè)序。

1.2.4序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建獲得的序列用Bioedit v7.0.9軟件打開(kāi)并核對(duì)峰圖和堿基序列。將自測(cè)序列通過(guò)NCBI進(jìn)行比對(duì)，選擇并下載可靠的序列建立矩陣（表1）。借助MEGA5.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)并修整，截平首位后保存用于發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立采用最大似然法，借助于RaxML v7.2.6軟件完成。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的序列信息及GenBank登錄號(hào)

1.2.5孢子懸浮液制備選取菌落轉(zhuǎn)為黃綠色的黃曲霉菌培養(yǎng)皿，取5 mL無(wú)菌水（含1%吐溫-80）于培養(yǎng)皿中，用接種環(huán)將孢子輕輕刮下，將含有孢子的無(wú)菌水轉(zhuǎn)移到含有玻璃珠的離心管中，震蕩1 min，過(guò)濾出去雜質(zhì)和菌絲，收集濾液備用。用血球計(jì)數(shù)板和顯微鏡計(jì)算孢子數(shù)量。

1.2.6黃曲霉菌產(chǎn)毒力的測(cè)定取3個(gè)裝有25 mL PDB培養(yǎng)基錐形瓶，分別加入BZ、ZX、ZK孢子懸浮液（孢子懸浮液終濃度為105CFU/mL），于26 ℃條件下振蕩培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)結(jié)束后，抽濾，菌球干燥后稱量，濾液收集后送至人人實(shí)驗(yàn)（北京）科技有限公司檢測(cè)黃曲霉毒素含量（方法：參照GB 5009.22—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定方法）。

1.2.7體外抑菌實(shí)驗(yàn)配制不同濃度的檸檬醛，取1 mL檸檬醛和50 ℃ 24 mL PDA培養(yǎng)基充分混合后倒平板，使化合物的終濃度分別為90，180，360，720，1 440 mg/L。每個(gè)培養(yǎng)皿上均勻涂布100 μL 1×106CFU/mL的孢子懸浮液，以無(wú)菌水為對(duì)照，于26 ℃條件下培養(yǎng)40 h后計(jì)算孢子數(shù)量，建立毒力方程。具體方法是使用DPS 7.05軟件將化合物濃度轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)，將抑制率轉(zhuǎn)化為概率。結(jié)果表明，濃度與抑制率呈一元線性回歸關(guān)系。通過(guò)分析顯著的線性關(guān)系，可以比較化合物與病原菌毒力的強(qiáng)弱，并可計(jì)算出作為藥物毒性重要指標(biāo)的有效抑制濃度（EC50）。

1.2.8檸檬醛對(duì)實(shí)際藥材樣本感染黃曲霉菌的防控研究本試驗(yàn)基于“反式培養(yǎng)”模式（人為對(duì)未染菌藥材接種）考察染菌枳殼、澤瀉的霉變情況。制備黃曲霉菌ZX、ZK孢子懸浮液，藥材以每一份10 g進(jìn)行儲(chǔ)藏研究，每一份中接種5 mL 1×106CFU/mL的孢子懸浮液（澤瀉接種ZX，枳殼接種ZK），待菌液吸收完全后，采用不直接接觸的方式，用小盒子裝上檸檬醛放置在每份藥材里，檸檬醛的含量分別為0，1，2，4，8，16 μL/g。在30 ℃，90%濕度下儲(chǔ)藏一段時(shí)間。每天觀察記錄霉變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)研究結(jié)果

從中藥材上分離得到2株疑似黃曲霉菌的菌株，編號(hào)為ZK和ZX，其在PDA上的單菌落形態(tài)如圖1所示，菌落質(zhì)地為致密絲絨狀，有時(shí)中央部分呈絮狀；菌落基本呈圓形，平坦或現(xiàn)輻射狀至不規(guī)則的溝紋；顏色最初呈白色，隨后變黃色，然后變成黃綠色，老后顏色變暗。根據(jù)GB 4789.16—2016，從菌落形態(tài)上分析，該兩株菌基本符合黃曲霉菌的國(guó)標(biāo)描述。

圖1 ZK和ZX在PDA上的菌落形態(tài)

菌株在顯微鏡下呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)如圖2所示，可以看出ZK和ZX的結(jié)構(gòu)與黃曲霉菌3.4408基本類似，且和GB 4789.16—2016里關(guān)于黃曲霉菌的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子的形態(tài)描述基本一致，即菌絲具分隔，分生孢子頭呈球狀，分生孢子小梗柱狀；分生孢子梗壁厚，無(wú)色，粗糙；分生孢子多為球形或近球形、粗糙。

圖2 顯微鏡下黃曲霉菌3.4408（BZ）和2株疑似菌（ZK和ZX）的形態(tài)

2.2 分子學(xué)研究結(jié)果

經(jīng)測(cè)序，得到2條ITS序列，分別為ZK和ZX。通過(guò)將所得到的序列在GenBank中進(jìn)行Blast搜索和比對(duì)，ZK的序列比對(duì)后結(jié)果為Aspergillus flavus，相似性為 98.59%～100%；ZX的序列比對(duì)后的結(jié)果為Aspergillus flavus，相似性為98.42%～99.82%。

比對(duì)后的ITS數(shù)據(jù)包括本研究測(cè)序得到的2條新序列及從GenBank中下載的19條序列，分屬于曲霉屬的 6個(gè)種，即：Aspergillus flavus（6條），Aspergillus pseudoglaucus（3條），Aspergillus proliferans（1條），Aspergillus ruber（3條），Aspergillus carneus（3條），Aspergillus destruens（2條）以及一條外群序列（Neocarpenteles acanthosporum，EF669992）。比對(duì)后并切除模糊區(qū)域后的序列，包括缺失位點(diǎn)，總長(zhǎng)度為619 bp。經(jīng) RaxML v7.2.6軟件分析后，得到的最大似然（ML）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)包括6種共19個(gè)代表菌株以及一個(gè)外群。本研究獲得的序列均與Aspergillus flavus聚于同一分支，且支持率達(dá)到100%。

圖3 ZK和ZX的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 黃曲霉菌產(chǎn)毒力的測(cè)定結(jié)果

黃曲霉菌純培養(yǎng)6 d后的菌球干質(zhì)量和黃曲霉毒素B1產(chǎn)量結(jié)果如表2所示，整體上看菌球的干質(zhì)量和毒素含量成正比，黃曲霉菌的生長(zhǎng)量越大，產(chǎn)毒越高。比較同一物種不同菌株之間存在明顯的個(gè)體差異，黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)模式菌株CGMCC 3.4408（BZ）與ZK之間的產(chǎn)毒量相差3個(gè)數(shù)量級(jí)?！吨袊?guó)藥典2020》規(guī)定藥材中黃曲霉毒素B1的限量標(biāo)準(zhǔn)為5 μg/kg，本試驗(yàn)中ZK產(chǎn)毒量3.01 μg/kg，產(chǎn)毒能力較弱，而ZX產(chǎn)毒量345 μg/kg，說(shuō)明藥材源的黃曲霉菌存在一定的產(chǎn)毒能力，不能忽視其危害，被污染的中藥材存在飲食風(fēng)險(xiǎn)。

表2 黃曲霉菌生長(zhǎng)量和產(chǎn)毒量結(jié)果

2.4 檸檬醛體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)孢子計(jì)數(shù)試驗(yàn)，研究了檸檬醛對(duì)ZK和ZX的體外抑制作用。高濃度下，檸檬醛能完全抑制黃曲霉菌BZ，且對(duì)ZK和ZX有強(qiáng)抑制作用，EC50分別為163.65 mg/L，719.42 mg/L和689.19 mg/L（表3）。檸檬醛對(duì)不同來(lái)源黃曲霉菌的抑制作用不同，檸檬醛可以作為一種有效的抑菌活性物質(zhì)抑制中藥材黃曲霉變。

表3 檸檬醛對(duì)黃曲霉菌的抑制效果

2.5 檸檬醛對(duì)藥材染菌防控結(jié)果

黃曲霉菌的適宜生長(zhǎng)條件為25～30 ℃，相對(duì)濕度80%～90%，本實(shí)驗(yàn)以澤瀉、枳殼為研究對(duì)象，分離得到的黃曲霉菌能成功感染澤瀉和枳殼，如圖4中的CK所示，藥材表面長(zhǎng)出黃綠色菌絲。從總體上看，隨著檸檬醛濃度的增大，藥材表面霉變程度減弱，檸檬醛濃度為4 μL/g時(shí)能完全抑制澤瀉霉變，檸檬醛濃度為8 μL/g時(shí)能完全抑制枳殼霉變，表明檸檬醛對(duì)中藥材由黃曲霉菌感染引起的霉變由較好的防控作用。

圖4 檸檬醛對(duì)藥材感染黃曲霉菌的抑制結(jié)果

3 結(jié)論與討論

微生物的分類鑒定方法主要包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法和現(xiàn)代的分子生物學(xué)方法，依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行分類的方法是微生物分類鑒定的主要手段。然而僅憑裸眼觀察很難區(qū)分形態(tài)相近的種，近年來(lái)隨著科學(xué)的進(jìn)步發(fā)展，分子生物學(xué)方法的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越明顯。朱麗萍等[15]用ISSR分子生物學(xué)分類法鑒定了25株紅曲菌株，該方法為紅曲菌株的分類鑒定提供綜合參考信息。本研究同樣以形態(tài)學(xué)觀察為基礎(chǔ)，以分子學(xué)手段為輔助，有效鑒定目標(biāo)菌，提高了研究的可信度和科學(xué)性。

對(duì)黃曲霉菌的防控研究大多采用標(biāo)準(zhǔn)模式菌株為對(duì)象，可能是基于可靠性和可比較性的角度去考慮。然而僅以標(biāo)準(zhǔn)模式菌株作為研究對(duì)象缺乏科學(xué)性，研究抑菌活性物質(zhì)對(duì)中藥材霉變的控制效果，不僅僅要研究其對(duì)黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑制作用，對(duì)能感染中藥材的黃曲霉菌的抑制研究很有必要。此外，本研究設(shè)計(jì)了實(shí)際中藥材樣本感染黃曲霉菌的實(shí)驗(yàn)，相比于體外抑菌實(shí)驗(yàn)，模擬中藥材染菌更能說(shuō)明檸檬醛抑菌的可靠性，以及應(yīng)用于霉變防控的可行性。

本研究結(jié)果還能說(shuō)明來(lái)源于不同中藥材品種的黃曲霉菌的產(chǎn)毒能力存在差異，因此在今后中藥材儲(chǔ)藏中，可以依據(jù)菌株間產(chǎn)毒差異性從而篩選出不產(chǎn)毒菌株，深入探索抑制黃曲霉生長(zhǎng)及黃曲霉毒素產(chǎn)生的機(jī)制，為中藥材儲(chǔ)藏中黃曲霉菌的防控提供理論指導(dǎo)。

此外，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，抑菌圈是抑菌研究的常用方法。但是，抑菌圈只能定性說(shuō)明某活性物質(zhì)對(duì)目標(biāo)菌有抑制能力，抑制能力的強(qiáng)弱無(wú)法定量分析。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃曲霉菌的抑菌研究方法是孢子計(jì)數(shù)法，這是一種定量方法。通過(guò)比較EC50能客觀的判斷檸檬醛對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和中藥材源菌株的抑制效果。

本研究以實(shí)際中藥材樣本探索了檸檬醛對(duì)中藥材黃曲霉菌感染的防控作用，下一步，要深入研究黃曲霉菌的抑制機(jī)制，為黃曲霉菌的抑制和天然檸檬醛防霉劑的開(kāi)發(fā)提供更可靠的數(shù)據(jù)支撐。